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        電針干預(yù)對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜結(jié)構(gòu)和SIRT1/HMGB1信號通路的影響*

        2022-12-07 13:38:42黃文韜李朵朵
        云南中醫(yī)中藥雜志 2022年11期
        關(guān)鍵詞:骨關(guān)節(jié)激動劑滑膜

        黃文韜,李 冰△,陳 恒,李 武,李朵朵

        (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410005,2.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208)

        膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種涉及膝骨變性并累及周圍組織(特別是滑膜組織)的退行性關(guān)節(jié)疾病,發(fā)病機制復(fù)雜,其中慢性低度炎癥是驅(qū)動關(guān)節(jié)退化的主要原因之一[1]。隨著人口老齡化的加劇,KOA在臨床中的發(fā)病率逐年上升,發(fā)病率已經(jīng)增加到45%,在老年人中高達80%,致殘率約53%,嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量[2]。KOA的發(fā)生發(fā)展是一個長期慢性的不可逆過程,常采用保守治療和手術(shù)治療,尚無特效藥,在傳統(tǒng)中醫(yī)中認(rèn)為KOA病在筋骨,電針作為中醫(yī)藥的特色治療法,已經(jīng)被證實在KOA的保守治療方面發(fā)揮良好的療效,但作用機制尚不明確。臨床KOA患者大多表現(xiàn)出明顯的滑膜炎癥,減少炎癥介質(zhì)(白細胞介素、腫瘤壞死因子)的積聚與釋放,可以減輕KOA所致膝骨紅腫、疼痛等癥狀,滑膜炎癥可能是關(guān)節(jié)破壞的重要因素[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin,SIRT1)在滑膜細胞炎癥反應(yīng)中扮演重要角色,其高表達可降低高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和促炎因子的表達,增加滑膜細胞的壽命[4-5]。本研究在以往的研究基礎(chǔ)上,以SIRT1激動劑為對照,探討電針干預(yù)對KOA模型大鼠滑膜SIRT1/ HMGB1信號通路表達的影響,以期為臨床治療KOA提供實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 32只SPF級雄性SD大鼠,8周齡,體質(zhì)量約(200±20)g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,實驗生產(chǎn)許可證號[SCXK(湘)2019-0004],在湖南省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心[SYXK(湘)2020-0008]飼養(yǎng),實驗程序根據(jù)湖南省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心管理規(guī)定進行,允許大鼠在恒定溫度、濕度和光暗循環(huán)(20~25℃;55±10 %;12 h/12 h明暗光照循環(huán),自由飲水和攝食。

        1.2 實驗試劑 SRT2104(批號:SC0272),碧云天生物技術(shù)有限公司;IL-1β ELISA試劑盒(批號:E-EL-R0012c)、IL-6 ELISA試劑盒(批號:E-EL-R0015c),Elabscience公司;SIRT1抗體(批號:60303-1-1g),proteintech公司;HMGB1抗體(批號:66525-1-1g),proteintech公司;HRP標(biāo)記山羊抗大鼠(批號:G0001-2L),Servicebio公司。SIRT1、HMGB1和β-actin引物,上海生物工程有限公司。

        1.3 主要儀器 SDZ-ⅡB型華佗牌電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,中國),Envision2105型酶標(biāo)儀(PE公司);ChemiDoc MP 型全能型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);ABI7500型實時熒光定量PCR儀(美國Thermo公司);DYY-6C型電泳儀(中國北京六一);D3024R臺式高速冷凍離心機(DRAGONLAB,中國)。

        1.3 方法

        1.3.1 模型制備與分組[6]大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,隨機分為正常組、模型組、電針組、SIRT1激動劑組(SRT2104,25mg/kg),每組8只。除正常組外,其余各組參考文獻誘導(dǎo)KOA模型:3%戊巴比妥鈉(2 mg/kg)腹腔注射麻醉,分別在造模的第1、4、7 d,于左膝關(guān)節(jié)間隙處注射4%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL,然后按壓1 min,來回屈伸關(guān)節(jié)使藥液吸收,右膝不做處理。以Lequesne MG評分評估膝骨關(guān)節(jié)炎功能障礙程度,并判斷造模是否成功。

        1.3.2 干預(yù)方法 在模型復(fù)制成功后第3 d,將SD大鼠固定在鼠板上,參照《實驗針灸學(xué)》[7]選取穴位位置:內(nèi)膝眼、外膝眼、陰陵泉穴,采用華佗牌針0.25 mm×25 mm進行針刺,穴位深度3~5 mm,針柄處連接華佗牌SDZ-ⅡB型電子針療儀,電流輸出強度1 mA,疏密波型,刺激10 min/次,每日1次,連續(xù)14 d;對照組給予相同時間相同時長的固定。激動劑組[8]腹腔內(nèi)注射SIRT1激動劑SRT2104溶液(采用10%DMSO生理鹽水稀釋至2.5 mg/mL,2 mL),從實驗第1 d開始,每周注射2次。正常組腹腔注射2 mL 10%DMSO生理鹽水溶液。

        1.3.3 行為學(xué)測試 Lequesne MG評分包括4個指標(biāo)之和:①局部疼痛度(無疼痛0分,患肢收縮1分,收縮伴輕度全身反應(yīng)2分,收縮伴重度全身反應(yīng)3分);②步態(tài)改變度(正常行走0分,輕度跛行1分,跛行明顯2分,患肢不參與行走3分);③關(guān)節(jié)腫脹度(無腫脹0分,輕度腫脹1分,重度腫脹2分);④關(guān)節(jié)活動度(活動角度>90°0分,活動角度45°~90°1分,活動角度15°~45°2分,活動角度15°3分)。以此,評價膝骨關(guān)節(jié)炎損傷嚴(yán)重程度。

        1.3.4 樣本采集 行為學(xué)評估結(jié)束后,采用3%戊巴比妥(2 mg/kg)麻醉大鼠,大鼠膝骨關(guān)節(jié)處注入1 mL生理鹽水收集大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜液,-80℃保存待用;然后剖取膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織,每組中4只浸泡于固定液(4%多聚甲醛),保存待用;剩余組織置于凍存管中,保存于-80℃。

        1.3.5 Elisa法檢測膝關(guān)節(jié)滑膜液IL-1β和IL-6的含量變化 取凍存的關(guān)節(jié)滑膜液,梯度解凍后,將試劑盒平衡至室溫,按照試劑盒說明書檢測膝關(guān)節(jié)滑膜液IL-1β和IL-6的含量變化。

        1.3.6 HE染色檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學(xué)變化 大鼠膝關(guān)節(jié)組織在固定液中固定15~20 d后,常規(guī)石蠟包埋,切片,制作成4 μm厚的石蠟切片,脫蠟、蘇木素和伊紅染色,封片,光學(xué)顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學(xué)變化。

        1.3.7 Western-blot法檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1表達變化 取凍存的膝關(guān)節(jié)滑膜組織100 mg,加入RIPA裂解液1 mL和100 μL PMSF溶液(1 mmol/kg),低溫勻漿,靜置30 min,離心(12000 r,5 min,4 ℃)取上清液,采用核酸蛋白溶度儀測定總蛋白的濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入SIRT1和HMGB1蛋白和內(nèi)參蛋白β-actin一抗,4 ℃孵育過夜,洗膜,加入二抗孵育,ECL試劑顯影,成像系統(tǒng)獲取條帶圖像,Quantity One軟件定量分析蛋白相對表達水平。

        1.3.8 RT-PCR法檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1基因表達變化 取上述凍存的海馬組織,加入1 mL Trizol,低溫下勻漿,裂解5 min,提取樣本總RNA,核酸蛋白測定儀定量。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件為2× SYBR Mix 10 μL,ddH2O 8 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,cDNA 1 μL。擴增條件為95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃ 10 s,60℃ 30 s,72 ℃ 2 min,40個循環(huán)。以GADPH為內(nèi)參,反應(yīng)結(jié)束后以2-ΔΔCt法計算分析目的基因SIRT1和HMGB1 mRNA相對表達水平。引物序列:SIRT1:Forward:5′-TCTCCCAGATCCTCAAGCCAA-3′,Reverse:5′-TGTCCGGGATATATTTCCTTTGC-3′,93bp;HMGB1:Forward:5′-GTCCACACACCCTGCATATTG-3′,Reverse:GTCCTCAGGTAAGGAGCAGAAC-3′,213bp;β-actin:Forward:5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′,Reverse:5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′,223 bp。

        2 結(jié)果

        2.1 電針對大鼠膝骨關(guān)節(jié)行為學(xué)的影響 各組大鼠造模后和治療后Lequesne MG評分如表1所示,造模后,與正常組比較,其余各組大鼠左膝關(guān)節(jié)局部疼痛腫脹與活動度增加、步態(tài)改變顯著,Lequesne MG評分總分明顯升高(P<0.01),提示模型復(fù)制成功。干預(yù)后,與模型組比較,電針組和SIRT1激動劑組可改善大鼠左膝關(guān)節(jié)腫脹與活動度、局部疼痛、步態(tài),Lequesne MG評分總分明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

        表1 各組大鼠干預(yù)前后膝骨關(guān)節(jié)行為學(xué)比較

        2.2 電針對大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜液IL-1β和IL-6含量的影響 與正常組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜液中IL-1β和IL-6含量明顯增多(P<0.01);與模型組比較,電針組和SIRT1激動劑組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜液中IL-1β和IL-6含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表2。

        2.3 電針對大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)病理學(xué)的影響 正常組大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜上皮組織形態(tài)正常,滑膜細胞排列有序,無炎性細胞浸潤;模型組大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜上皮組織嚴(yán)重增生,滑膜細胞核大深染,排列不整齊,可見彌漫大量炎性細胞;電針組和激動劑組膝骨關(guān)節(jié)滑膜上皮組織輕微增生,滑膜細胞核染較淺,可見少量散在炎性細胞。

        正常組

        2.4 電針對大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1蛋白表達的影響 與正常組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SIRT1蛋白相對表達量明顯降低,HMGB1蛋白相對表達量明顯增加(P<0.01);與模型組比較,電針組和SIRT1激動劑組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SIRT1蛋白相對表達量明顯增加,HMGB1蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見圖2,表3。

        A.正常組 B.模型組 C.電針組 D.SIRT1激動劑組

        表3 各組大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1蛋白相對表達量比較

        2.5 電針對大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1mRNA表達的影響 與正常組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SIRT1mRNA相對表達量明顯降低,HMGB1mRNA相對表達量明顯增加(P<0.01);與模型組比較,電針組和SIRT1激動劑組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SIRT1mRNA相對表達量明顯增加,HMGB1mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表4。

        表4 各組大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1mRNA相對表達量比較

        3 討論

        膝骨關(guān)節(jié)炎在傳統(tǒng)中醫(yī)屬于痹證范疇,稱之為“骨痹”、“膝弊”等,與外感風(fēng)寒濕邪和(或)年長體衰勞損等導(dǎo)致肝腎虧虛、經(jīng)脈閉阻有關(guān),治療多從筋論治,調(diào)衡筋經(jīng)陰陽氣血、疏利關(guān)節(jié)[9]。針灸可通過經(jīng)絡(luò)、腧穴的傳導(dǎo)作用內(nèi)病外治,在臨床治療KOA中不僅可以有效調(diào)節(jié)疼痛中樞,改善微循環(huán),還能避免藥物治療時的不良反應(yīng),提高了治療的安全性[10]。位于膝關(guān)節(jié)之髕骨下兩側(cè)的內(nèi)膝眼穴和外膝眼穴,具有“通經(jīng)活絡(luò),消腫止痛”之功,再配以“清利濕熱、益腎調(diào)經(jīng)”的陰陵泉穴,在治療KOA發(fā)揮良好的作用。本研究選取以上穴位,予以現(xiàn)代與傳統(tǒng)相結(jié)合的電針刺激,明顯改善大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹、活動度、局部疼痛與步態(tài)。

        KOA疾病早期即觀察到滑膜的慢性炎癥反應(yīng),其可導(dǎo)致血管形成增加、關(guān)節(jié)炎性浸潤疼痛、腫脹僵硬等,抑制滑膜細胞增殖和炎性因子釋放,可有效控制關(guān)節(jié)變形,減緩KOA病程。膝骨滑膜主要由內(nèi)膜常駐巨噬細胞和成纖細胞構(gòu)成,與下層血管化結(jié)締組織等構(gòu)成了滑膜液的主要成分,對于維持正常軟骨和關(guān)節(jié)功能發(fā)揮重要作用[11]。SIRT1是一種NAD+依賴性III類蛋白脫乙酰酶,可抑制細胞代謝凋亡、炎癥反應(yīng)等,促進各類細胞存活。有研究發(fā)現(xiàn),SIRT1參與KOA滑膜炎癥發(fā)展,低表達能夠?qū)е麓傺装Y因子的釋放,增加血管裔的生成,減少軟骨細胞的存活率[12]。此外,SIRT1激動劑能夠減少Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜細胞中IL-1β的表達,有效緩解滑膜炎癥[13]。

        HMGB1是炎癥反應(yīng)的重要警報器,當(dāng)機體受到炎癥侵襲時,其賴氨酸殘基乙酰化,然后釋放至胞質(zhì)或胞外參與炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)。臨床研究顯示,關(guān)節(jié)炎患者血清和滑膜液中HMGB1的表達明顯升高,并與病情的發(fā)展成正相關(guān),是關(guān)節(jié)軟骨損傷的標(biāo)志蛋白;HMGB1還能與IL-1形成復(fù)合體,促進KOA大鼠模型滑膜成纖維細胞釋放相關(guān)促炎因子,并加速關(guān)節(jié)軟骨的降解[14-15]。SIRT1是乙?;?去乙?;揎椀纳嫌握{(diào)節(jié)劑,可以通過去乙?;饔谜{(diào)節(jié)HMGB1的釋放,從而減弱炎癥介質(zhì)(IL-1β、IL-6等)的釋放[16]。SIRT1過表達能夠抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細胞HMGB1乙?;秃速|(zhì)易位[17]。SIRT1新型激動劑SRT2104,能減輕葡聚糖硫酸鈉(DDS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的炎癥,還能顯著減弱LPS誘導(dǎo)的IL-6釋放[18]。

        本研究選用激動劑SRT2104和電針干預(yù)KOA大鼠模型,發(fā)現(xiàn)其能有效改善滑膜炎性浸潤和損傷,減少滑膜液中炎性因子(IL-1β和IL-6)的釋放,調(diào)控滑膜組織中SIRT1和HMGB1蛋白基因的相對表達,因此,我們有理由認(rèn)為SIRT1/ HMGB1信號通路在KOA的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色。電針作為一種綠色療法已經(jīng)在臨床KOA的治療效果中被肯定,本研究為其提供更加科學(xué)和深入的理論支撐。

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