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        金剛丸對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠NF-κB p65表達(dá)及IL-1、IL-6、TNF-α的影響*

        2022-12-07 13:38:52沈琳玲朱亮亮葉子豐匡浩銘匡建軍
        云南中醫(yī)中藥雜志 2022年11期
        關(guān)鍵詞:戊酸金剛雌二醇

        陳 杰,沈琳玲,戎 寬,朱亮亮,葉子豐,匡浩銘,匡建軍

        (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410006;3.湖南省中醫(yī)藥研究院,湖南 長(zhǎng)沙 410006)

        絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是生活中十分常見(jiàn)的一種疾病,好發(fā)于更年期后的絕經(jīng)后女子,由于女子在絕經(jīng)后卵巢功能逐步萎縮,導(dǎo)致雌激素釋放能力降低、內(nèi)分泌發(fā)生改變,可引起骨量丟失、骨強(qiáng)度降低、骨組織結(jié)構(gòu)損壞、骨質(zhì)易脆,骨折風(fēng)險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[1]。當(dāng)婦女體內(nèi)雌激素水平下降,引起相關(guān)免疫反應(yīng)增強(qiáng)、T細(xì)胞增殖,炎癥因子大量分泌[2],大量研究表明[3]IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子對(duì)破骨細(xì)胞的生成與活化起著重要作用,同時(shí)亦有研究表明[4]NF-κB家族是與破骨細(xì)胞的生成與活化密切相關(guān)。由于PMOP西藥治療有一定的不良反應(yīng),開(kāi)展PMOP的中醫(yī)藥治療有著深遠(yuǎn)意義。在中醫(yī)理論中PMOP癥屬“骨痿”,病機(jī)以腎虛為主,當(dāng)治以補(bǔ)腎壯骨。金剛丸在臨床應(yīng)用中,治療PMOP療效較好。本研究通過(guò)去卵巢法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型,觀察金剛丸對(duì)其血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量及NF-κB p65表達(dá)的影響,以探索金剛丸治療PMOP的機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用56只6月齡SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)未經(jīng)產(chǎn)雌性大鼠,體重(300±20)g,動(dòng)物來(lái)源:湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)批號(hào):43602500000352。

        1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 金剛丸:具有補(bǔ)腎生津、溫陽(yáng)益髓之功。將酒浸肉蓯蓉、酒浸菟絲子、鹽炒杜仲、萆薢各120 g等分為細(xì)末,隨后通過(guò)與酒煮豬腰子蜜制成丸。(藥物來(lái)源:陜西天洋制藥有限公司生產(chǎn);藥品批準(zhǔn)文號(hào):Z61020726,丸劑,成人劑量:每日2次,每次1丸,每丸3.5 g)。戊酸雌二醇片(法國(guó) DELPHARM Lille S.A.S.生產(chǎn);藥品批號(hào):219A;成人劑量:每日1次,每次1粒,每粒1mg)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 10%水合氯醛(上海山浦 批號(hào):20191016)、IL-1試劑盒(酶聯(lián)生物 批號(hào):ml037373)、IL-6試劑盒(酶聯(lián)生物 批號(hào):ml102828)、TNF-α試劑盒(酶聯(lián)生物 批號(hào):ml002859)、P65抗體(英國(guó)abcam 批號(hào):ab16502)、石蠟(Sigma)、中性樹(shù)膠(Sigma)、蘇木素(Wellbio)、PBS(7.2-7.6)(Wellbio)、伊紅(Wellbio)。

        1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

        名稱廠家全稱貨號(hào)臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)湖南湘儀H1650R搖床中國(guó)江蘇其林貝爾TS-1電泳儀中國(guó)北京六一DYY-6C轉(zhuǎn)膜儀中國(guó)北京六一DYCZ-40D磁力攪拌器中國(guó)雷磁JB-13普通冰箱中國(guó)奧克斯BCD-196A電磁爐荷蘭飛利浦HD4925精密PH計(jì)中國(guó)雷磁PHS-3C電子天平美國(guó)雙杰JJ224BC化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)廣州勤翔Chemiscope6100

        1.5 方法

        1.5.1 造模方法 模型組:用百分之十水合氯醛(0.3 mL/100 g),針對(duì)40只雌性SD大鼠采用腹腔內(nèi)麻醉的方式來(lái)展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。在手術(shù)臺(tái)上用剃毛器備皮后進(jìn)行消毒。在大鼠最下的肋骨水平、腹中線左/右側(cè)旁開(kāi)2~3 cm做一豎行切口,在進(jìn)入腹腔后可以發(fā)現(xiàn)一乳白色脂肪團(tuán),鈍性剝離后找到卵巢。在子宮及卵巢之間,用手術(shù)線結(jié)扎后摘除卵巢。假手術(shù)組:8只大鼠做同樣的手術(shù)切口,切除同等重量脂肪組織后立即縫合切口。術(shù)后連續(xù)3天,予以每只手術(shù)大鼠8萬(wàn)單位青霉素(1次/天)防止感染。

        1.5.2 分組方法 進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后,把56只SD大鼠劃分為空白組(NtCn=8)、假手術(shù)組(SHAMn=8)、去勢(shì)大鼠組(OVXn=40)。模型驗(yàn)證完成后,采用隨機(jī)數(shù)字表法把40只去勢(shì)大鼠均等的劃分為模型組、戊酸雌二醇組、金剛丸低劑量組、金剛丸中劑量組、金剛丸高劑量組共5組大鼠。

        1.5.3 干預(yù)方法 各組每天上午灌胃給藥1次,根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[5]中的方法,依據(jù)人類(lèi)和大鼠表面體積存在差異來(lái)進(jìn)行有效核算。具體方案如下:

        組別生藥含量水溶液含量戊酸雌二醇組0.09mg·kg-1·d-10.009mg·mL-1金剛丸低劑量組1.8 g·kg-1·d-10.18 g·mL-1金剛丸中劑量組3.6 g·kg-1·d-10.36 g·mL-1金剛丸高劑量組7.2 g·kg-1·d-10.72 g·mL-1

        對(duì)假手術(shù)組、空白組、模型組大鼠采用1 mL/100 g的蒸餾水灌胃。各組一共灌胃治療12周,每周6天,密切監(jiān)測(cè)體重變化,及時(shí)調(diào)節(jié)給藥劑量。

        1.5.4 標(biāo)本制作方法 給藥后12周取材。用水合氯醛實(shí)施麻醉后,開(kāi)腹找到腹主動(dòng)脈,使用真空采血管收集血液標(biāo)本。把收集的全血標(biāo)本放置于室溫中靜置,離心后收集血清以用于檢測(cè)。隨后剪斷大鼠腹主動(dòng)脈,再取雙側(cè)脛骨,以4%中性多聚甲醛固定,封口袋密封后保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.6 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定 用HE染色法觀察骨組織形態(tài),ELISA法檢測(cè)血清IL-1、IL-6、TNF-α含量,Western Blot法檢測(cè)大鼠股骨NF-κB p65的表達(dá)。

        2 結(jié)果

        2.1 金剛丸對(duì)大鼠骨組織形態(tài)的影響 HE染色結(jié)果顯示:正常組和假手術(shù)組骨小梁形態(tài)完整、無(wú)明顯斷裂,骨髓腔正常,骨細(xì)胞排列均勻;模型組骨小梁形態(tài)模糊、廣泛斷裂,骨髓腔增寬,骨細(xì)胞排列散亂;戊酸雌二醇組、金剛丸高、中、低劑量組可見(jiàn)骨小梁形態(tài)較模型組改善、結(jié)構(gòu)較為緊密,骨髓腔減小,骨外膜排列較為齊整。見(jiàn)圖1。

        圖1 金剛丸對(duì)大鼠骨組織形態(tài)的影響(HE,×100)

        2.2 金剛丸對(duì)大鼠血清TNF-α的影響 相較于空白組和假手術(shù)組對(duì)比分析而言,模型組及各給藥組血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相較于模型組相對(duì)比分析而言,各給藥組血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相較于戊酸雌二醇組、金剛丸中、低劑量組比較分析而言,金剛丸高劑量組血清IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);金剛丸高劑量組與其余各給藥組相比較而言,對(duì)血清IL-1、IL-6、TNF-α的抑制作用更為突出。見(jiàn)表1。

        表1 金剛丸對(duì)大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α的影響

        2.3 金剛丸對(duì)大鼠股骨NF-κB p65表達(dá)的影響 相較于空白組和假手術(shù)組對(duì)比分析而言,模型組股骨p65含量明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相較模型組對(duì)比分析而言,各給藥組股骨p65含量均有所下降,其中戊酸雌二醇組、金剛丸高劑量組下降明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。金剛丸高、中、低劑量組組間比較,高劑量組股骨p65含量比中劑量組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),中劑量組股骨p65含量比低劑量組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著金剛丸藥物濃度的升高,股骨p65含量呈下降趨勢(shì)。見(jiàn)表2、圖2。

        表2 金剛丸對(duì)大鼠股骨NF-κB p65表達(dá)的影響

        圖2 金剛丸對(duì)大鼠股骨組織中蛋白電泳的影響

        3 討論

        PMOP隨著中國(guó)老齡化加劇發(fā)病率也隨之快速升高,越來(lái)越多的中老年絕經(jīng)后女性遭此病困擾。當(dāng)女性絕經(jīng)后機(jī)體內(nèi)雌激素分泌量會(huì)迅速降低,進(jìn)而引起骨代謝紊亂、骨量減少、骨脆性增加,其臨床表現(xiàn)多樣,以全身關(guān)節(jié)疼痛、骨骼退化變形、脆性骨折最為常見(jiàn)[6]。由骨形成和骨吸收構(gòu)成的骨重建,發(fā)生于人體生命的每個(gè)階段,當(dāng)破骨細(xì)胞超過(guò)成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成后OP隨即發(fā)生。在正常人體代謝過(guò)程中,成骨與破骨所需時(shí)間完全不同,相較于破骨細(xì)胞而言成骨細(xì)胞需要消耗更多的時(shí)間才能有效的實(shí)現(xiàn)同等量的骨形成[7]。因此抑制破骨細(xì)胞活性、降低破骨細(xì)胞功能、減少骨吸收在抗骨質(zhì)疏松治療過(guò)程中占重要地位。依據(jù)大量研究得到結(jié)果顯示[8-9],IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子和NF-κB信號(hào)通路對(duì)于調(diào)節(jié)骨細(xì)胞功能以及促進(jìn)機(jī)體機(jī)能具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

        絕經(jīng)后女性卵巢功能減退,體內(nèi)雌激素分泌驟然減少,相關(guān)免疫活動(dòng)隨之增強(qiáng),大量炎性因子被釋放到體內(nèi),機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性炎癥環(huán)境之中[10]。有研究顯示[3],炎性因子促進(jìn)骨吸收的機(jī)制可能在于其作用于間質(zhì)干細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體,加快了破骨細(xì)胞分化成熟。IL-1、TNF-α均可誘導(dǎo)核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)分泌增加,核因子-κB受體活化因子(RANK)與RANKL結(jié)合后可激活NF-κB信號(hào)通路,促使破骨細(xì)胞成熟。IL-6對(duì)PMOP有著雙重調(diào)節(jié)作用,既能增強(qiáng)骨的形成,也能促進(jìn)骨的吸收,總的來(lái)說(shuō),促進(jìn)骨吸收作用大于骨形成[11]。NF-κB是體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞增殖分化及炎癥的重要轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB信號(hào)通路在沒(méi)有被激活時(shí),NF-κB抑制因子IκBα與NF-κB緊密結(jié)合在一起,分布于胞質(zhì)中。當(dāng)RANKL與RANK相結(jié)合后在受體因子的影響作用下IκBα激酶 IKKs被活化,IKKs分解IκBα,促使其與NF-κB分離,NF-κB隨即移動(dòng)到細(xì)胞核內(nèi),能夠參與到骨細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中[12]。NF-κB家族有五個(gè)成員,NF-κB p65是其中之一,有研究表明[13]:NF-κB p65與骨密度(BMD)呈負(fù)相關(guān)。因此,NF-κB p65在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理過(guò)程中起到了重要作用,它將可能成為研究藥物對(duì)PMOP治療作用的新靶點(diǎn)。

        PMOP是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上的名稱,中醫(yī)典籍中尚未找到該疾病名稱的明確記錄,根據(jù)全身骨痛、乏力、肢體痿軟等臨床表現(xiàn),“骨痹”、“骨痿”的癥狀與其十分相似。結(jié)合臟腑、八綱、氣血精液辨證,該病涉及腎、肝、脾等多個(gè)臟腑,病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí),腎精虧虛、肝郁血虛在中醫(yī)中屬于常見(jiàn)的虛證證型,其中腎精虧虛尤為緊要[14]。腎主骨,乃先天之本,腎精充沛則髓化生有源,骨質(zhì)得養(yǎng)[15]。石敏等研究[16]指出:中醫(yī)“腎”在臨床中能夠顯著地作用于OPG/RANK/RANKL等信號(hào)通路并直接參與到調(diào)解中,骨的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝與其之間是密切關(guān)聯(lián)的,腎精虧虛則骨髓化生無(wú)源,導(dǎo)致PMOP發(fā)生。金剛丸是補(bǔ)腎經(jīng)典方,全方包含的中藥材為肉蓯蓉、菟絲子、杜仲、萆薢、酒煮豬腰。菟絲子性味辛甘,有補(bǔ)腎益精填髓的作用,現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[17]:其主要活性成分菟絲子黃酮可通過(guò)下調(diào)Bax蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-2、OPG蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞凋亡;肉蓯蓉味甘咸、性溫,有補(bǔ)腎陽(yáng)益精血的功效,朱剛等[18]研究發(fā)現(xiàn):肉蓯蓉醇提物可以上調(diào)OP模型大鼠骨鈣素、鈣離子及血清堿性磷酸酶水平,進(jìn)而提高大鼠股骨生物力學(xué)功能;杜仲性味甘溫,入肝腎經(jīng),善于補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨,研究發(fā)現(xiàn)[19]:杜仲不僅能促進(jìn)成骨細(xì)胞活化進(jìn)而促進(jìn)骨形成,且可以遏制炎癥因子活性,降低其對(duì)骨破壞的誘導(dǎo)作用;萆薢味苦,善于分清泄?jié)?,祛腎濁而留腎精,藥理研究[20]認(rèn)為其可從分子水平對(duì)成骨細(xì)胞UMR106促增殖活,抑制破骨樣多核細(xì)胞形成;配豬腰子血肉有情之品,暖腎以補(bǔ)先天之氣,酒煮后助行藥力,加強(qiáng)補(bǔ)腎功效。諸藥聯(lián)合,共同發(fā)揮補(bǔ)腎健骨、填精生髓的功效。

        本研究采用3個(gè)梯度的金剛丸濃度及陽(yáng)性對(duì)照藥戊酸雌二醇片干預(yù)模型大鼠,在干預(yù)12周后檢測(cè)大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量及股骨組織中NF-κB p65的含量。研究結(jié)果顯示,戊酸雌二醇組、金剛丸高、中、低劑量組可見(jiàn)骨小梁形態(tài)較模型組改善、結(jié)構(gòu)較為緊密,骨髓腔減小,其中金剛丸高劑量組改善明顯,骨外膜排列整齊??梢?jiàn)金剛丸可明顯改善骨組織形態(tài)。金剛丸能降低大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量和股骨組織NF-κB p65的蛋白表達(dá),降低骨質(zhì)疏松大鼠炎癥程度,參與調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的增殖和分化,這可能是金剛丸能夠緩解PMOP臨床癥狀的重要因素。且其作用對(duì)于金剛丸呈現(xiàn)一定劑量依賴性。總而言之,本研究證實(shí)金剛丸能降低IL-1、IL-6、TNF-α含量、下調(diào)NF-κB p65表達(dá)水平,其治療作用與藥物濃度呈正相關(guān),初步闡釋了金剛丸抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

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