黎曉冬，李志林，武海燕，何潤西，羅雪妮，謝學(xué)軍

0引言

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)是具有調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及分化等多種作用的細(xì)胞因子，其介導(dǎo)的經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路通過調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)重塑參與各種人體組織的纖維化進(jìn)程。其中TGF-β介導(dǎo)的病理性纖維化可破壞正常的視網(wǎng)膜神經(jīng)組織，誘發(fā)纖維血管瘢痕增生和繼發(fā)性視網(wǎng)膜脫落，導(dǎo)致不可逆的視力喪失，這可能與增殖性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，故本文主要對TGF-β在增殖性視網(wǎng)膜疾病中的作用機(jī)制及未來治療前景作簡要闡述。

1 TGF-β簡述

TGF-β超家族包括TGF-β、激活素、抑制素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長分化因子等30多個成員，TGF-β是TGF-β家族蛋白中研究最多的多功能肽生長分化因子，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上有70%～82%同源性的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種亞型，其在控制細(xì)胞生長發(fā)育、增殖、分化、凋亡，組織修復(fù)，血管生成及炎癥等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1-2]，TGF-β失調(diào)可介導(dǎo)多種病理過程，導(dǎo)致組織纖維化、慢性炎癥、免疫抑制等[3-4]。TGF-β最初以無活性的同型二聚體形式存在，經(jīng)mRNA翻譯后，無活性的TGF-β前體被加工并分泌到ECM中，與TGF-β結(jié)合蛋白(TGF-β binding protein，LTBP)和潛伏期相關(guān)蛋白(latent protein，LAP)形成TGF-β/LAP/LTBP復(fù)合物保持無活性狀態(tài)[5]，隨后被纖溶酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)及血小板反應(yīng)蛋白等多種蛋白酶激活釋放出活化的TGF-β，與細(xì)胞膜上的TGF-β受體2(TGF-β receptor 2，TGFR2)相結(jié)合，此時涉及經(jīng)Smads介導(dǎo)的經(jīng)典信號通路和非Smads介導(dǎo)的其它信號通路，經(jīng)典信號通路通過TGFR2募集并激活TGFR1后以激活Smad2和Smad3信號，再與Smad4結(jié)合生成Smads復(fù)合體易位至細(xì)胞核與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和輔因子相互作用以激活或抑制靶基因表達(dá)[6]；非Smads介導(dǎo)的信號通路包括PI3K/Akt/mTOR信號通路、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun terminal kinase，JNK)通路及Rho樣GTPase信號通路。多數(shù)TGF-β受體位于細(xì)胞內(nèi)，研究表明TGF-β誘導(dǎo)的低水平細(xì)胞表面TGF-β受體激活時，可以迅速將細(xì)胞內(nèi)的TGF-β受體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，從而增加細(xì)胞表面TGF-β受體的豐度和細(xì)胞對TGF-β信號的反應(yīng)[7]。

2眼內(nèi)的TGF-β

TGF-β三種亞型在眼內(nèi)房水及玻璃體液中均能檢測到，目前尚未檢測到活性的TGF-β1，且玻璃體內(nèi)87%的TGF-β以無活性形式存在。TGF-β2是房水和玻璃體液中的主要亞型，研究顯示房水中TGF-β2∶TGF-β3∶TGF-β1三種具有活性的亞型的比率為1∶0.4∶0[8]，此外，通過免疫熒光定位的方法顯示TGF-β三種亞型在眼前節(jié)及眼后段組織細(xì)胞中分布不均勻，見表1。

表1 眼部TGF-β三種亞型分布情況

3 TGF-β與纖維化

纖維化過程通常持續(xù)數(shù)月至數(shù)年，涉及到生長因子，炎癥介質(zhì)和ECM組分之間的動態(tài)相互作用，可以影響全身任何器官，且有數(shù)據(jù)表明因器官衰竭導(dǎo)致的死亡率高達(dá)45%[9]。纖維化可以定義為組織正常結(jié)構(gòu)成分破壞時，細(xì)胞通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)及異常的ECM蛋白(包括膠原蛋白、層黏連蛋白、纖連蛋白和肌腱蛋白)，過量異常ECM蛋白不僅導(dǎo)致分泌的ECM積累過多，還能間接重塑ECM，導(dǎo)致瘢痕和無功能組織的形成[10]。因此肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化與ECM積累是纖維化過程的主要影響因素。目前研究證實TGF-β信號通路在肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中起主要作用，通過激活經(jīng)典信號通路中Smad3直接與基因啟動子結(jié)合誘導(dǎo)促纖維化分子的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)肌成纖維細(xì)胞活化和ECM沉積[11]；也有研究表明TGF-β可以直接通過上調(diào)ECM蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)ECM積累[12]。病理性瘢痕真皮成纖維細(xì)胞分泌高水平的TGF-β，通過激活素樣激酶 5(activin-like kinase 5，ALK5)發(fā)出纖維化基因轉(zhuǎn)錄的信號。既往研究在傷口愈合的體外模型中發(fā)現(xiàn)了ALK5的小分子抑制劑—galunisertib，該研究用外源性TGF-β誘導(dǎo)人真皮成纖維細(xì)胞纖維化，體外劃痕實驗顯示，galunisertib能顯著增強(qiáng)細(xì)胞遷移和體外傷口閉合，且基因表達(dá)分析顯示纖維化基因表達(dá)顯著減弱，抗纖維化基因表達(dá)增加，蛋白質(zhì)合成測定證實了藥物活性及轉(zhuǎn)錄結(jié)果。這表明galunisertib可對真皮成纖維細(xì)胞發(fā)揮抗纖維化作用，同時提高體外傷口閉合率[13]。

4 TGF-β與增殖性視網(wǎng)膜疾病

TGF-β信號通路介導(dǎo)纖維化過程破壞正常的視網(wǎng)膜神經(jīng)組織，誘發(fā)纖維血管瘢痕增生和繼發(fā)性視網(wǎng)膜脫落，導(dǎo)致不可逆的視力喪失。與纖維化相關(guān)的增殖性視網(wǎng)膜疾病主要為增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitroretinopathy，PVR)、新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性(neovascular age-related macular degeneration，nARMD)和增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)等纖維血管膜形成相關(guān)的疾病[14]。

4.1TGF-β與PVR PVR是經(jīng)手術(shù)修復(fù)視網(wǎng)膜脫離后的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，其發(fā)病特點是視網(wǎng)膜表面形成無血管的纖維細(xì)胞性增殖膜。這些繼發(fā)性視網(wǎng)膜前膜的形成與收縮導(dǎo)致視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變，致視網(wǎng)膜褶皺、撕裂甚至牽引性視網(wǎng)膜脫離[15]；研究表明，PVR繼發(fā)的纖維膜主要由RPE細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等異質(zhì)細(xì)胞群和過量的ECM組成，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是纖維膜內(nèi)的主要收縮細(xì)胞表型。在EMT期間細(xì)胞間黏附和頂面-底側(cè)細(xì)胞極性的缺失使得RPE細(xì)胞表型發(fā)生改變，TGF-β誘導(dǎo)RPE細(xì)胞為成纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和過量的ECM生成參與纖維膜的形成，并在應(yīng)力纖維中表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白，增加纖維膜收縮性，導(dǎo)致牽引性視網(wǎng)膜脫離，上述過程在PVR的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[16]。此外，多項研究證明TGF-β/Smad經(jīng)典信號通路在RPE細(xì)胞EMT過程的重要性；Saika等[17]通過特定視網(wǎng)膜下纖維化的小鼠模型發(fā)現(xiàn)阻斷TGF-β/Smad信號通路下游的關(guān)鍵蛋白Smad3，可以抑制RPE細(xì)胞的EMT過程從而阻止PVR的進(jìn)展。Choi等[18]利用人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19模型研究發(fā)現(xiàn)，抗纖維化藥物吡非尼酮可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞樣表型，且呈劑量依賴性，其通過阻止活性Smad2/3復(fù)合物的核轉(zhuǎn)位抑制TGF-β信號通路。此外，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG binding protein，MeCP2)的下調(diào)也可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3激活和Ⅰ型膠原和纖連蛋白的表達(dá)，通過染色質(zhì)免疫沉淀法發(fā)現(xiàn)MeCP2與TGF-β結(jié)合，且P-MeCP2-421在PVR膜中高表達(dá)，提示MeCP2特別是P-MeCP2-421可能在PVR發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，靶向MeCP2可能是PVR的一種潛在治療方法[19]。另有研究顯示，PVR患者玻璃體液中TGF-β1表達(dá)明顯增高，但其表達(dá)量與PVR臨床嚴(yán)重程度分級無直接關(guān)系，可能在其病程的初始階段具有更大的相關(guān)性[20]。

同時，TGF-β非經(jīng)典信號通路在調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞的EMT過程中也起重要作用，如TGF-β2通過激活p38 MAPK、ERK1/2和Jagged/Notch信號抑制人RPE細(xì)胞中EMT過程[21]，且TGF-β2誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號途徑的激活有助于RPE細(xì)胞中Ⅰ型膠原的表達(dá)與合成[22]。此外，在PVR患者的玻璃體和增殖纖維膜中檢測到TGF-β水平上調(diào)，尤其是TGF-β2及其受體表達(dá)水平上調(diào)與PVR嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[23]。Trichostatin A是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，已被證明可同時抑制經(jīng)典TGF-β/Smad信號通路和非經(jīng)典通路，并通過阻止α-平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白、Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Snail及Slug的表達(dá)上調(diào)抑制TGF-β誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT過程[24]；有研究在PVR小鼠模型和體外人ARPE-19細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)的激活與TGF-β2信號通路密切相關(guān)，YAP還是PVR中EMT和纖維化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，抑制YAP可能是PVR治療干預(yù)的潛在靶點[25]。此外，一項動物實驗表明活化的凝血因子X(activated blood coagulation factor X，F(xiàn)Xa)可以通過促進(jìn)RPE的EMT過程加劇外傷性PVR的發(fā)展[26]。上述研究提示對于防治PVR的新藥研發(fā)前景十分可觀。

4.2TGF-β與nARMD 年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)是一類涉及黃斑深層和周圍脈管系統(tǒng)的病理改變，從而導(dǎo)致中心視力喪失的致盲性眼底疾病，是60歲以上人群不可逆失明的原因，影響全球近2億人。根據(jù)病理特征主要分為干性ARMD和nARMD，以黃斑周圍玻璃膜疣為特征的干性ARMD約占所有患者的80%～85%，通常具有更好的視力預(yù)后；其余15%～20%的患者為nARMD，黃斑處脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)導(dǎo)致視網(wǎng)膜出血和滲出，視力下降嚴(yán)重，治療不及時最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜下纖維化、瘢痕化及永久性視力喪失，約占因ARMD導(dǎo)致視覺功能嚴(yán)重下降患者的80%[27]。視網(wǎng)膜下纖維化是CNV之后的傷口愈合反應(yīng)，其特征是TGF-β等生長因子及炎性因子可以誘導(dǎo)RPE細(xì)胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致過量ECM的實質(zhì)性重塑[28]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，在ARPE-19細(xì)胞中，TGF-β誘導(dǎo)EMT的經(jīng)典介質(zhì)即轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，Snail可促進(jìn)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白和緊密連接蛋白的表達(dá)減少，介導(dǎo)纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移活性，TGF-β2促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞通過介導(dǎo)尿激酶型纖溶酶原激活物的表達(dá)侵入膠原凝膠，誘導(dǎo)過量Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的合成與表達(dá)[29]，這兩種ECM蛋白參與視網(wǎng)膜下纖維化破壞視網(wǎng)膜功能和神經(jīng)元變性[30]。Moon等[31]發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑硼替佐米可有效抑制RPE細(xì)胞的增殖、遷移及阻斷TGF-β1信號通路介導(dǎo)的RPE細(xì)胞EMT；維甲酸受體-γ激動劑也可以抑制RPE細(xì)胞的EMT，延緩TGF-β介導(dǎo)的視網(wǎng)膜下纖維化反應(yīng)[32]。另有研究發(fā)現(xiàn)腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，AM)及其受體活性修飾蛋白2(receptor activity-modifying proteins，RAMP2)敲除的小鼠模型表現(xiàn)出新生血管形成、視網(wǎng)膜下纖維化和巨噬細(xì)胞侵襲，使用TGF-β抑制劑后AM-RAMP2敲除小鼠視網(wǎng)膜下纖維化明顯改善，表明AM-RAMP2是通過阻斷RPE細(xì)胞EMT抑制視網(wǎng)膜下纖維化[33]。因此，nARMD患者接受TGF-β抑制劑的治療，可能在一定程度上延遲EMT和視網(wǎng)膜下纖維化的發(fā)生，從而獲得更好的視力預(yù)后?？扇苄詷O低密度脂蛋白受體(sVLDLR)是一種內(nèi)源性Wnt信號抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)過度激活Wnt信號通路可以增強(qiáng)TGF-β通路，而sVLDLR可能是部分通過抑制Wnt信號通路達(dá)到抑制nARMD中視網(wǎng)膜下纖維化進(jìn)展的目的[34]。

TGF-β在nARMD中可能具有促血管生成功能。通過靶向激光損傷RPE和Bruch膜誘導(dǎo)CNV生成的動物模型是研究nARMD的金標(biāo)準(zhǔn)動物模型，研究發(fā)現(xiàn)在小鼠CNV形成過程中TGF-β1和TGF-β2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，而對照組正常小鼠的TGF-β為低表達(dá)水平；此外，通過腹膜內(nèi)或玻璃體內(nèi)注射TGF-β抑制劑LY2157299可以下調(diào)視網(wǎng)膜中VEGF-A和TNF-α的表達(dá)水平，這有助于預(yù)防或阻止早期CNV形成與進(jìn)展[35]；且研究證實nARMD患者房水、玻璃體液及黃斑RPE中TGF-β表達(dá)顯著升高[36]，表明抑制TGF-β信號通路對于nARMD的治療具有潛在意義。目前有爭議的是有研究支持TGF-β在nARMD中還有抗血管生成功能。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，過度表達(dá)的活性TGF-β1可誘導(dǎo)脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮而未發(fā)現(xiàn)任何CNV跡象[37]；在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型中，腹膜內(nèi)注射人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞遷移到視網(wǎng)膜中并通過TGF-β1表達(dá)可以抑制CNV的形成[38]；這可能與TGF-β1通過抑制微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并下調(diào)局部VEGF和VEGF受體的表達(dá)水平有關(guān)。因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在nARMD早期階段，TGF-β顯示出抗血管生成功能，而在類似于急性損傷或晚期階段TGF-β則促進(jìn)血管生成[36]，如何選擇靶向TGF-β的治療還需要更多有針對性的研究闡明其具體作用機(jī)制。

4.3TGF-β與PDR 糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的慢性神經(jīng)及微血管并發(fā)癥之一，并且仍然是全球?qū)е乱暳适Ш褪鞯闹饕鄣准膊≈弧Ｌ悄虿淖円暰W(wǎng)膜正常的細(xì)胞間相互作用，并導(dǎo)致嚴(yán)重的微血管異常，血-視網(wǎng)膜屏障破壞和神經(jīng)元功能受損；隨著病情進(jìn)展，視網(wǎng)膜缺血缺氧加重，釋放大量VEGF、炎癥及纖維化因子，促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管、纖維血管膜形成，導(dǎo)致玻璃體積血甚至牽拉性視網(wǎng)膜脫離，這表明已發(fā)展至PDR階段，視覺嚴(yán)重受損且預(yù)后很差[39]。Ahmed等在14例PDR患者的纖維血管膜中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞及循環(huán)纖維細(xì)胞可以經(jīng)EMT分化肌成纖維細(xì)胞并促進(jìn)PDR中的視網(wǎng)膜病理性纖維化，同時體外研究也證實暴露于TGF-β1、結(jié)締組織生長因子、白細(xì)胞介素-1β及TNF-α條件下的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變，失去內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(內(nèi)皮型一氧化氮合酶和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白)的表達(dá)并開始表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)志物(α-平滑肌肌動蛋白和成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1)[40]。肌成纖維細(xì)胞可通過分泌MMP-2和MMP-9促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移并釋放大量VEGF，導(dǎo)致新生血管的形成[28]。TGF-β尤其是TGF-β2在PDR患者的玻璃體中表達(dá)上調(diào)，與PDR期間VEGF的產(chǎn)生密切相關(guān)。Braunger等[41]發(fā)現(xiàn)長時間缺乏TGF-β基因的TGFBR2小鼠模型表現(xiàn)出PDR的表型特征，視網(wǎng)膜有大量微動脈瘤、毛細(xì)血管滲漏和視網(wǎng)膜新生血管形成，血管平滑肌樣細(xì)胞和增厚的基底膜替代分化的周細(xì)胞覆蓋視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管壁，在4月齡的TGFBR2小鼠模型中觀察到終末期PDR表型特征，包括大量內(nèi)皮細(xì)胞丟失、視網(wǎng)膜新生血管形成導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離及玻璃體積血等。此外，TGF-β可通過結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)發(fā)揮促纖維化作用，且CTGF在晚期PDR發(fā)生的血管纖維化轉(zhuǎn)換中十分關(guān)鍵。糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β表達(dá)上調(diào)，CTGF mRNA表達(dá)增加，終末期PDR模型中TGF-β在瘢痕樣纖維膜中表達(dá)顯著上調(diào)[42]。

內(nèi)皮素(endothelin，ET)是一種有效的血管收縮劑，以3種同種型存在，即ET-1、ET-2和ET-3，其中ET-1及其受體ETA已被證明可介導(dǎo)高血糖和DR期間視網(wǎng)膜血流減少[43]，DR早期階段，ET-1可通過受體ETA介導(dǎo)周細(xì)胞凋亡[44]；William等發(fā)現(xiàn)PDR增殖膜中ET-1和成纖維細(xì)胞免疫染色比特發(fā)性前膜中更明顯，且ET-1和S100A4(成纖維細(xì)胞標(biāo)志物)染色共定位表明ET-1在PDR中上調(diào)并可能參與TGF-β介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變與增殖，故ET-1有可能成為防治PDR的潛在靶點[45]。一項臨床對照研究發(fā)現(xiàn)，血清TGF-β1可以成為預(yù)測PDR進(jìn)展的生物標(biāo)志物，且可以作為評估抗VEGF治療后臨床療效的指標(biāo)[46]。也有研究顯示，PDR及合并新生血管性青光眼的PDR患者房水中TGF-β水平明顯升高，檢測房水TGF-β水平有助于及時調(diào)整治療方案和監(jiān)測治療反應(yīng)[47]。

5小結(jié)與展望

TGF-β信號通路介導(dǎo)的纖維化在PVR、ARMD及PDR等增殖性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機(jī)制中十分關(guān)鍵，RPE細(xì)胞EMT過程及ECM的過量積累是纖維化的兩個主要特征表現(xiàn)；阻斷TGF-β及其下游通路中蛋白激活的抑制劑可能是防治增殖性視網(wǎng)膜疾病的潛在治療靶點之一，然而，基于TGF-β信號通路中調(diào)節(jié)因子的多樣性和潛在信號傳導(dǎo)途徑的復(fù)雜性，抑制視網(wǎng)膜組織病理性纖維化可能需要多種因素的聯(lián)合靶向治療。特異性阻斷參與肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的下游TGF-β信號通路，保留視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)內(nèi)環(huán)境及正常功能所需的TGF-β信號通路可能更有利于增殖性視網(wǎng)膜疾病的早期防治。隨著有關(guān)纖維化眼病發(fā)病機(jī)制的深入研究，我們期望能夠研發(fā)出新的有效的對抗病理性纖維化的藥物及手段，助力于臨床上增殖性視網(wǎng)膜疾病的防治。