李園媛，鄭燕林，李建超，惠延年，馬士航，黃 慧，王 芳，馬宏杰

0引言

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是3歲以下嬰幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，也可見于年長的兒童甚至成年人[1-3]。腫瘤早期局限于眼球內(nèi)，隨病程進(jìn)展可發(fā)生眼外轉(zhuǎn)移甚至致命[4]。近30a來，RB的治療取得明顯進(jìn)展，靜脈化學(xué)藥物療法、眼動(dòng)脈超選介入化療等可以保留患眼，但存在明顯的副作用[5]。尋求更有效、安全的藥物或生物療法是必要的。

RB細(xì)胞可分泌多種生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF蛋白在RB細(xì)胞中呈高表達(dá)[6]，VEGF是RB研究中最徹底和廣泛被探索的促血管生成因子，在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移中起重要作用[7-10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信號(hào)通路調(diào)控與增殖、轉(zhuǎn)化、存活、遷移、血管生成相關(guān)的多種因子，包括基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)[11-13]。有報(bào)道稱，PI3K信號(hào)通路可被包括VEGF在內(nèi)的多種生長因子激活[14-15]。PI3K/AKT信號(hào)通路激活后，下游靶基因HIF-1a被激活，調(diào)節(jié)刺激血管生成基因的轉(zhuǎn)錄，如VEGF和MMP-9[16-19]。HIF-1a、MMP-9在腫瘤細(xì)胞侵襲中具有特殊作用，二者可通過多種信號(hào)作用方式相互調(diào)節(jié)[20-21]。機(jī)體缺氧時(shí)，組織缺氧釋放大量的MMP-9，從而促使MMP-9信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)增加，即HIF-1a上調(diào)MMP-9的表達(dá)。阻斷HIF-1a/MMP-9信號(hào)通路可促進(jìn)腫瘤無功能血管的發(fā)生，這些無功能血管不能有效輸送腫瘤生長所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，達(dá)到延緩和抑制腫瘤生長的目的[22-25]。因此，VEGF/PI3K/AKT、HIF/MMP-9等信號(hào)通路為靶點(diǎn)的研究可作為抑制RB的重點(diǎn)。然而，目前關(guān)于VEGF/PI3K/AKT、HIF/MMP-9信號(hào)通路在RB中的研究較少，其作用仍需進(jìn)一步探索。前期研究發(fā)現(xiàn)，水蛭提取物具有抑制成纖維細(xì)胞增生的作用[26]，水蛭提取液可有效抑制人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞WERI-Rb-1細(xì)胞系增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。因此，本研究通過VEGF/PI3K/AKT通路及相關(guān)因子，豐富和完善水蛭提取液對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲作用的影響，為其潛在的治療作用提供理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料WERI-RB-1細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，No.3131C0001001200012)。水蛭干粉(蘭州安泰堂中藥飲片公司；生產(chǎn)批號(hào)：14082702；GMP證書號(hào)：甘J0071；水蛭提取液提取方法及濃度選擇參考文獻(xiàn)[26])；Human VEGF Elisa試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；總RNA抽提試劑TRIZOL、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit、HIF-1a、MMP-9鼠單克隆抗體(美國Santa公司)； 預(yù)染蛋白Marker(美國NEB公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)；PVDF膜(美國Hybond公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(南京凱基生物公司)。RT-PCR儀(美國Thermo Fisher公司)；垂直電泳槽、DYY-6C電泳儀、Image Lab凝膠分析系統(tǒng)(美國Bio-rad 公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)WERI-RB-1細(xì)胞從液氮容器中快速取出，提前備好約50℃無菌水，迅速解凍，2500g 20℃離心10min，丟棄上清液，加入2mL完全培養(yǎng)基RPMI-1640重懸細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種到6孔板中，然后在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每隔1天更換1次。待培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞生長至70%～80%時(shí)以1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)取對(duì)數(shù)生長期的WERI-RB-1細(xì)胞，以5×105cells/mL接種于6孔板中，每孔加入800μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后分3組，對(duì)照組加完全培養(yǎng)基，0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組分別加入含0.04、0.08U/mL的含藥培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

1.2.3ELISA檢測(cè)VEGF表達(dá)水平將試劑盒和樣品(各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液)平衡至室溫，樣品分別用標(biāo)本稀釋液稀釋(1∶100)，混合均勻后各取100μL加入到96板孔。設(shè)陰陽性對(duì)照各一孔組，同時(shí)設(shè)加入100μL標(biāo)準(zhǔn)通用稀釋液作為空白對(duì)照孔，每組設(shè)6孔。37℃孵育60min。吸取孔內(nèi)液體，用洗滌液連續(xù)洗滌3次，每次停留30s后吸取孔內(nèi)液體，并在吸水紙上拍干，空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加生物素化抗體工作液(每孔100μL)，37℃孵育60min。用洗滌液連續(xù)洗滌3次，吸水紙上拍干。空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加酶結(jié)合物工作液(每孔100μL)，37℃孵育30min。每孔加入顯色底物(TMB)100μL，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液100μL，混勻后即刻測(cè)量450nm處OD值。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)HIF-1a和MMP-9mRNA相對(duì)表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，分別加入1mL TRIZOL，充分勻漿、萃取RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR法檢測(cè)HIF-1a和MMP-9 mRNA表達(dá)情況，配制20μL PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件： 95℃ 10min，95℃ 15s，58℃ 50s，58℃ 50s，45個(gè)循環(huán)，β-Actin 為內(nèi)參基因，使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo公司)分析各檢測(cè)樣本的CT值，并通過2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。所有樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。引物序列見表1。

1.2.5WesternBlot檢測(cè)HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，裂解提取蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量，35μg樣本蛋白混合等體積上樣，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液封閉，室溫孵育2h，加入PI3K(1∶800)、p-AKT(1∶500)、HIF-1a(1∶500)、MMP-9(1∶800)一抗，4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10min，加入二抗(1∶10000)，室溫孵育45min，顯色，并采用LabWorks軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶β-Actin比值表示目的蛋白的表達(dá)水平，計(jì)算p-AKT、PI3K、HIF-1a及MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1水蛭提取液對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中VEGF表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=93.4，P<0.05)，且水蛭提取液組均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。0.04、0.08U/mL水蛭提取液對(duì)VEGF表達(dá)的抑制率分別為32.43%、38.92%。

圖1 ELISA檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá) aP<0.05，bP<0.01 vs 對(duì)照組。

2.2水蛭提取液對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)HIF-1a和MMP-9mRNA的影響RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組細(xì)胞HIF-1a和MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.7、74.5，均P<0.05)，且水蛭提取液組均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。0.04、0.08U/mL水蛭提取液對(duì)HIF-1a mRNA表達(dá)的抑制率分別為27.64%和24.75%，對(duì)MMP-9 mRNA表達(dá)的抑制率分別為43.97%和51.48%。

圖2 RT-PCR檢測(cè)HIF-1a和MMP-9 mRNA的表達(dá) A：HIF-1a；B：MMP-9。aP<0.05，bP<0.01 vs 對(duì)照組。

2.3水蛭提取液對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)PI3K和p-AKT蛋白的影響Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組細(xì)胞PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((F=51．8、70.4，均P<0.05)，且水蛭提取液組均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。0.04、0.08U/mL水蛭提取液對(duì)PI3K蛋白表達(dá)的抑制率分別為33.27%、29.83%，對(duì)p-AKT蛋白表達(dá)的抑制率分別為52.07%、30.21%。

圖3 Western Blot檢測(cè)PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平 A：Western Blot檢測(cè)結(jié)果；B：PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)水平；C：p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平。aP<0.05，bP<0.01 vs 對(duì)照組。

2.4水蛭提取液對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)HIF-1a和MMP-9蛋白的影響Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組細(xì)胞HIF-1a、MMP-9蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=66.2、80.9，均P<0.05)，且水蛭提取液組均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。0.04、0.08U/mL水蛭提取液對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的抑制率分別為39.49%、47.23%，對(duì)HIF-1a蛋白表達(dá)的抑制率分別為55.81%、43.85%。

圖4 Western Blot檢測(cè)MMP-9和HIF-1a蛋白相對(duì)表達(dá)水平 A：Western Blot檢測(cè)結(jié)果；B：MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平；C：HIF-1a蛋白相對(duì)表達(dá)水平。aP<0.05，bP<0.01 vs 對(duì)照組。

3討論

本研究首先觀察水蛭提取液處理WERI-RB-1細(xì)胞后VEGF的表達(dá)情況，通過ELISA分析發(fā)現(xiàn)，0.04、0.08U/mL水蛭提取液處理WERI-RB-1細(xì)胞48h后，VEGF表達(dá)被抑制，0.04、0.08U/mL水蛭提取液對(duì)VEGF表達(dá)的抑制率分別為32.43%、38.92%，呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)。李先建等[28]關(guān)于水蛭素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用及其分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素能抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲，其機(jī)制可能是通過下調(diào)VEGF表達(dá)。諸佳瑜[29]研究水蛭含藥血漿、血清對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的影響，結(jié)果表明水蛭含藥血漿、血清對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞具有抑制增殖、遷移及抑制VEGF表達(dá)的作用。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本研究采用RT-PCR法檢測(cè)經(jīng)0.04、0.08U/mL水蛭提取液處理的WERI-RB-1細(xì)胞中MMP-9和HIF-1a mRNA相對(duì)表達(dá)水平，采用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-9和HIF-1a蛋白及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K和p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，水蛭提取液干預(yù)下細(xì)胞HIF-1α和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平下降，HIF-1a、MMP-9、PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低。張景容等[30]研究水蛭素對(duì)特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化病的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水蛭素能降低模型小鼠肺中AKT、p-AKT蛋白的表達(dá)量。另有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制RB細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[31]。

此外，本研究結(jié)果表明，水蛭提取液可能通過抑制WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)VEGF降低VEGF下游PI3K的表達(dá)，抑制p-AKT活性，進(jìn)一步抑制下游靶基因HIF-1a和MMP-9的表達(dá)，從而抑制RB血管生成和腫瘤生長。其次，水蛭提取液可能直接抑制了HIF-1a的表達(dá)，進(jìn)一步抑制下游靶基因VEGF和MMP-9的表達(dá)，而VEGF又抑制了PI3K/AKT通路的活性，從而發(fā)揮抑制腫瘤血管生成和生長的作用。此外，水蛭提取液也可能直接抑制MMP-9的活性，進(jìn)而抑制MMP-9對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解，從而抑制VEGF從ECM中釋放，并在一定程度上抑制VEGF-VEGF受體的相互作用，最終抑制PI3K/AKT通路的活性，抑制RB血管生成和轉(zhuǎn)移。既往研究觀察水蛭素對(duì)化療誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變(CIPN)的影響發(fā)現(xiàn)，水蛭素可明顯減輕奧沙利鉑(L-OHP)化療副作用，顯著抑制L-OHP誘導(dǎo)的CIPN小鼠體內(nèi)p38、HIF-1的過表達(dá)和MMP-9/2的活化，達(dá)到改善CIPN的作用[32]。另有研究觀察水蛭素對(duì)急性肺損失大鼠的影響發(fā)現(xiàn)，水蛭素可減少大鼠體內(nèi)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和MMP-12的釋放，推測(cè)水蛭素可抑制肺損傷引起的炎癥和纖維化，并作為抗炎介質(zhì)在肺保護(hù)中發(fā)揮作用[33]。因此，初步推測(cè)，水蛭提取液可能通過VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路和HIF-1a、MMP-9因子發(fā)揮抑制RB的作用，這為水蛭提取液的抗腫瘤作用機(jī)制提供了新的見解。然而，本研究的局限性和不足在于采用的藥物干預(yù)劑量分組較少，且0.04U/mL水蛭提取液的干預(yù)劑量對(duì)HIF-1a、PI3K和p-AKT的抑制作用強(qiáng)于0.08U/mL水蛭提取液，后期研究應(yīng)進(jìn)一步縮小劑量之間的跨度，設(shè)置更多劑量組，尋找最佳的藥物干預(yù)劑量。此外，由于時(shí)間和經(jīng)費(fèi)限制，本研究觀察時(shí)間點(diǎn)較少，不能夠顯示動(dòng)態(tài)的量效、時(shí)效曲線，同時(shí)缺少陽性對(duì)照，未進(jìn)行刺激、抑制信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)證實(shí)相關(guān)通路的作用，后期研究將力爭(zhēng)進(jìn)一步完善。

表1 引物序列

綜上所述，水蛭提取液可能通過VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的信號(hào)及抑制MMP-9和HIF-1a的表達(dá)抑制RB的發(fā)生發(fā)展，提示VEGF/PI3K/AKT可能是水蛭提取液在RB治療中的一個(gè)有前途的靶點(diǎn)。雖然該結(jié)論還需要進(jìn)一步完善和驗(yàn)證，如進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)/體內(nèi)試驗(yàn)等，但本研究結(jié)果為目前研究RB提出了新的興趣點(diǎn)和潛在的研究價(jià)值。