李晶 馬鐵 宋成林 李濤 高海寧 姚婷婷 晉俊杰 張超 胡廣璇 刁小芮 衣雪潔 常波*

1.遼寧師范大學(xué)體育學(xué)院，遼寧 大連 116029 2.沈陽體育學(xué)院運(yùn)動人體科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110102 3.沈陽體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)室管理中心，遼寧 沈陽 110102 4.沈陽體育學(xué)院研究生部，遼寧 沈陽 110102 5.沈陽體育學(xué)院運(yùn)動與健康研究中心，遼寧 沈陽 110102

1 機(jī)械敏感離子通道概述

自然界中，凡是具有生命的個體在生長發(fā)育過程中時刻接受來自外界的機(jī)械刺激從而產(chǎn)生感知和響應(yīng)。在哺乳動物中，骨的穩(wěn)態(tài)感應(yīng)會受機(jī)械力刺激傳導(dǎo)[1]。機(jī)械敏感離子通道可以在毫秒級的時間內(nèi)充當(dāng)機(jī)械刺激的分子傳感器，并在打開時將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)的電信號或化學(xué)信號[2]，該通道是完整成孔的膜蛋白[3]?？身憫?yīng)施加在細(xì)胞膜上的機(jī)械刺激，控制通道的封閉和開放達(dá)到允許離子和其他溶質(zhì)流過細(xì)胞膜的目的[4]。

2 機(jī)械敏感陽離子通道蛋白Piezo1的生理特點(diǎn)

2010年，在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤(mouse neuroblastoma，N2A)細(xì)胞系的研究中，發(fā)現(xiàn)由Fam38A所調(diào)控的蛋白質(zhì)是一種離子通道，可以被壓力激活產(chǎn)生穩(wěn)定電流。研究者將其命名為 Piezo1，意義是“壓力”，Piezo1為N2A中產(chǎn)生機(jī)械力(壓力)激活電流所必需的，由Fam38B所編碼蛋白質(zhì)Piezo2，是響應(yīng)于背根神經(jīng)節(jié)(dorsalroot ganglion，DRG)神經(jīng)元的機(jī)械刺激所必需的，二者共同組成了目前的Piezo離子通道家族。Piezo通道是對陽離子具有非選擇滲透性的大型跨膜蛋白，對Na+、K+、Ca2+、Mg2+全部滲透，但更偏向Ca2+[5-6]。Piezo1蛋白的結(jié)構(gòu)在冷凍電鏡下是一種類似三葉螺旋槳的三聚體，包括一個中央離子傳導(dǎo)孔模塊和3個高度彎曲的非平面結(jié)構(gòu)葉片[7]。每個葉片有9個重復(fù)的結(jié)構(gòu)單元，每個單元有4個跨膜螺旋，這些螺旋單元通過梁狀結(jié)構(gòu)連接到孔中，葉片梁結(jié)構(gòu)可能形成杠桿狀的分子內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，用于中心孔的長距離機(jī)械門控[8-10]。Piezo1在神經(jīng)細(xì)胞[11]、軟骨細(xì)胞[12]等多種細(xì)胞[13-15]中表達(dá)。Piezo1的機(jī)械敏感性不需要借助其他蛋白質(zhì)或第二信使信號激活[16]，對細(xì)胞感受力學(xué)方面的壓力和機(jī)械力門控非選擇性陽離子電流的產(chǎn)生至關(guān)重要。

3 機(jī)械力通過Piezo1對骨代謝的影響

代謝性骨病一般是由于先天或后天原因使機(jī)體正常骨代謝過程和生理狀態(tài)紊亂，導(dǎo)致骨生化代謝發(fā)生障礙，其中以骨質(zhì)疏松最為常見。骨質(zhì)疏松主要以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨強(qiáng)度下降為主要特征，且骨質(zhì)疏松癥患者極易發(fā)生骨折。正常成人的骨骼中破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞處于一種動態(tài)平衡，使骨組織不斷更新以維持骨骼的強(qiáng)度和彈性；骨的動態(tài)平衡被破壞后會導(dǎo)致骨的丟失引起骨質(zhì)疏松[17-18]。骨作為承重器官，不斷受到來自身體內(nèi)部(肌肉)和外界(地球重力)力的影響[19]，該影響可增加骨骼強(qiáng)度[20-21]。缺乏機(jī)械力，如長期臥床和微重力環(huán)境下會減少骨量[22-23]。而Piezo1可以在生物體內(nèi)響應(yīng)機(jī)械力[24]，研究發(fā)現(xiàn)，Piezo的基因變化與機(jī)械力反應(yīng)、人類骨密度和骨折有關(guān)[25]，且Piezo1水平的降低與骨質(zhì)流失的增加關(guān)系密切[17]。所以Piezo1在骨組織中應(yīng)答機(jī)械力的潛在作用機(jī)制可以為改善骨代謝疾病提供參考。

3.1 機(jī)械力通過Piezo1影響間充質(zhì)干細(xì)胞分化的潛在機(jī)制

成骨細(xì)胞和骨髓脂肪細(xì)胞起源于骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)。而成骨與成脂過程“此消彼長”[26]。在骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)，BMSCs 向脂肪細(xì)胞分化能力增強(qiáng)，導(dǎo)致成骨分化和成脂分化的不平衡，骨折的風(fēng)險加大[27]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)對機(jī)械應(yīng)力的刺激十分敏感。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2 (extracellular regulated protein kinases l/2，ERK1/2)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)通路可響應(yīng)施加在脂肪干細(xì)胞 (adipose-derived stem cells，ADSCs)上的機(jī)械拉伸并將它轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)成骨信號[28]。

研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1在MSCs中介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[29]。Piezo1在MSCs中作為靜水壓(hydrostatic pressure，HP)刺激的感受體來激活ERK1/2和p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP2)表達(dá)，增加成骨細(xì)胞分化、減少成脂細(xì)胞分化。BMP2是成骨細(xì)胞從MSCs分化的重要生長因子[30]，而阻斷BMP2功能可抑制HP誘導(dǎo)的成骨標(biāo)記基因表達(dá)。使用 Yoda1(Piezo1特異性激活劑)刺激MSCs時成脂分化減弱，成骨細(xì)胞分化增強(qiáng)。MEK和p38 MAPK抑制劑會抑制HP和Yoda1誘導(dǎo)的BMP2表達(dá)。機(jī)械力的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要ERK1/2信號通路的激活[31]，所以ERK1/2和p38 MAPK可能在HP-Piezo1-BMP2表達(dá)中起信號分子的作用。在大鼠牙髓細(xì)胞中，ERK1/2 在低強(qiáng)度脈沖超聲處理后24 h被激活，但釕紅(離子通道阻滯劑)可以抑制ERK1/2的激活[32]。人類牙髓來源的MSCs(human dental pulp stem cells，HDP-MSCs)經(jīng)過短時間的Yoda1刺激使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，但是Yoda1誘導(dǎo)的Ca2+反應(yīng)被Piezo1通道抑制劑以及Piezo1特異的siRNA抑制[33]。該研究認(rèn)為，Piezo1通道被激活可以誘導(dǎo)ATP釋放、P2受體嘌呤信號傳導(dǎo)，以及下游信號通路PYK2和MEK/ERK的傳導(dǎo)來促進(jìn)MSC遷移，為調(diào)節(jié)MSC遷移的分子和信號機(jī)制提供新的見解。巧合的是，Piezo1在MC3T3-E1成骨細(xì)胞的遷移過程中作用巨大，敲除該細(xì)胞中Piezo1基因?qū)⒂绊懫溥w移能力[34]。

3.2 機(jī)械力通過Piezo1調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞平衡的潛在機(jī)制

骨的發(fā)生和生長包含成骨和破骨同時進(jìn)行，成骨細(xì)胞不斷分化成熟形成新骨質(zhì)，破骨細(xì)胞分泌酸性物質(zhì)和蛋白酶來吸收舊骨質(zhì)，使骨化中心向四周擴(kuò)展，骨質(zhì)不斷重建，骨組織體積增加[35-36]。二者的變化使凈骨量發(fā)生動態(tài)變化，所以平衡成骨-破骨過程至關(guān)重要。有趣的是，多個研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械載荷刺激成骨細(xì)胞系導(dǎo)致機(jī)械敏感陽離子Piezo1表達(dá)產(chǎn)生差異[37-39]。

3.2.1機(jī)械力通過Piezo1刺激YAP1和TAZ控制成骨細(xì)胞Wnt1表達(dá)：Hippo信號途徑的激酶鏈內(nèi)的轉(zhuǎn)錄共激活因子 YAP(yes-associated protein，YAP)和類似物 TAZ(transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ)在成熟的成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞中可以通過促進(jìn)骨形成并抑制骨吸收的方式調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)[40]。在小鼠的成骨分化過程中YAP1/TAZ表達(dá)增加，且骨形成相關(guān)因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor 2，Runx-2)、骨鈣素、骨橋蛋白等表達(dá)也相應(yīng)增加[41]，而Piezo1能夠調(diào)節(jié)YAP的核定位[42]。

成骨細(xì)胞中Piezo1敲除的小鼠在出生3 d后即出現(xiàn)多處骨折，并且表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松、骨量明顯減少等變化。尾部懸吊導(dǎo)致對照小鼠遠(yuǎn)端股骨骨量丟失，Piezo1基因敲除小鼠則沒有該表現(xiàn)；該處理增加了對照小鼠的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)表達(dá)，Piezo1基因敲除小鼠同樣沒有該表現(xiàn)，這顯示Piezo1基因敲除的小鼠對后肢卸載導(dǎo)致的骨丟失有一定抵抗力。該實(shí)驗(yàn)中對Piezo1敲除和對照小鼠的BMSCs衍生的成骨細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械壓縮干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)Piezo1通過YAP促進(jìn)Ⅱ型膠原酶(collagenase Ⅱ，COL2)和Ⅸ型膠原酶(collagenase Ⅸ，COL9)的表達(dá)，這些膠原酶抑制破骨細(xì)胞活性，所以機(jī)械力刺激Piezo1后通過YAP調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動態(tài)平衡[43]。在培養(yǎng)的骨細(xì)胞中由流體剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的Piezo1基因表達(dá)增加，而 Yoda1對Piezo1的刺激可以模擬流體剪切應(yīng)力對骨細(xì)胞的影響。向成年小鼠給藥Yozo1增加了骨量，模擬了機(jī)械負(fù)荷的影響。該實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步證明了在骨組織中Piezo1通過YAP1/TAZ控制Wnt1表達(dá)，流體剪切應(yīng)力通過刺激Piezo1來影響Wnt1和rankl表達(dá)，控制成骨或者破骨通路[21]。Wnt1通過增加細(xì)胞核內(nèi)的β-連環(huán)蛋白(Beta catenin，β-catenin)來提高骨形成相關(guān)因子Runx2的水平，增加成骨細(xì)胞的分化[44-45]。所以，在小鼠體內(nèi)，機(jī)械刺激通過Piezo1控制成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的平衡來調(diào)節(jié)骨量。

3.2.2機(jī)械力通過Piezo1控制成骨細(xì)胞中CaMKⅡ/Creb表達(dá)：骨骼細(xì)胞(骨吸收和骨形成)的協(xié)調(diào)功能維持鈣化組織(即骨)的穩(wěn)態(tài)，鈣化組織既儲存鈣又控制細(xì)胞外Ca2+的濃度[46]。Ca2+在骨骼細(xì)胞的調(diào)節(jié)中充當(dāng)關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)第二信使[47]，Ca2+的涌入可能導(dǎo)致CaMKⅡ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ)磷酸化并激活環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，Creb)途徑，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[48-49]。

在成骨細(xì)胞中敲除Piezo1的小鼠成年后發(fā)育遲緩，出現(xiàn)嚴(yán)重的骨發(fā)育缺陷。后肢懸吊的實(shí)驗(yàn)中，對比未干預(yù)小鼠懸吊小鼠的小梁骨礦物質(zhì)密度等指標(biāo)均明顯降低，而Piezo1敲除小鼠則沒有上述表現(xiàn)。同樣證明了Piezo1敲除小鼠對機(jī)械卸載導(dǎo)致的骨質(zhì)量和結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)變化具有一定抵抗力。并且將正常的骨細(xì)胞放在低重力模擬器中(模仿太空飛行)或使小鼠處于模仿臥床休息的條件下Piezo1表達(dá)下調(diào)。機(jī)械負(fù)荷刺激使對照小鼠Piezo1的mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著增加，并伴隨著成骨細(xì)胞功能標(biāo)記基因表達(dá)的增加，而敲除小鼠沒有該變化。利用流體剪切力刺激成骨細(xì)胞也得到了在體實(shí)驗(yàn)機(jī)械干預(yù)相似的結(jié)果[19]。Piezo1還可以使成骨細(xì)胞CaMKⅡ/Creb信號通路激活，導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化增加，而Piezo1敲除小鼠成骨細(xì)胞中CaMKⅡ和Creb的磷酸化水平降低，且伴隨著Runx2和激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor-4，ATF4)的蛋白表達(dá)表達(dá)降低，成骨分化受損[19]。這表明Piezo1是感受力刺激的響應(yīng)靶點(diǎn)，在Piezo1缺失后不會對力刺激做出相應(yīng)的反應(yīng)；且會通過CaMKⅡ/Creb信號通路影響成骨分化。

3.2.3機(jī)械力通過Piezo1控制成骨細(xì)胞AKT表達(dá)：絲氨酸/蘇氨酸激酶 AKT信號傳導(dǎo)在多種細(xì)胞代謝、細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長和分化途徑中具有關(guān)鍵作用[50]。骨細(xì)胞中硬化蛋白(Sclerostin，Sost)減少使Wnt/β-catenin 信號通路得到激活，促進(jìn)骨形成[51]，且Sost可以參與機(jī)械刺激的成骨作用[52]，尾部懸吊小鼠血清中的Sost水平增加，而機(jī)械負(fù)荷抑制了該表達(dá)[53]。

Piezo1激動劑Yoda1增加了細(xì)胞內(nèi)鈣動員，并劑量依賴性地降低了鼠類骨細(xì)胞系IDG-SW3中Sost的表達(dá)。對IDG-SW3細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械拉伸抑制了Sost的表達(dá)，這一結(jié)果被GsMTx4干預(yù)以及Piezo1基因沉默所逆轉(zhuǎn)。此外，通過用Akt抑制劑治療消除了機(jī)械拉伸對Sost表達(dá)的抑制[54]。這表示Piezo1可能通過AKT調(diào)節(jié)Sost的表達(dá)。另一項(xiàng)研究中，在成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞中Piezo1受到流體切應(yīng)力的刺激表達(dá)升高，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞關(guān)鍵基因Runx-2的表達(dá)。然而，使用小干擾RNA沉默Piezo1后則不會出現(xiàn)上述結(jié)果，且機(jī)械力刺激AKT/GSK-3β/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的效果被抑制[55]。這表示在MC3T3-E1細(xì)胞系中，Piezo1作為感受器感受外部機(jī)械力(流體剪切應(yīng)力)的刺激，誘導(dǎo)AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的激活，促進(jìn)成骨細(xì)胞Runx-2基因表達(dá)。

3.3 機(jī)械力通過Piezo1調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的潛在機(jī)制

關(guān)節(jié)軟骨是密集的結(jié)締組織，排列在關(guān)節(jié)表面上，為關(guān)節(jié)承受負(fù)荷提供降低摩擦[56]。軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨中存在的唯一細(xì)胞單元，承載來自內(nèi)部(牽張力、剪切力)和外部(機(jī)械應(yīng)力)力的刺激，而軟骨受到破壞使軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，或者受到炎癥影響產(chǎn)生相關(guān)的增生，則會造成膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

將Piezo1特異的siRNA轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞中以沉默Piezo1表達(dá)。然后，使用循環(huán)拉伸應(yīng)變(cyclic tensile strain，CTS)施加至沉默和對照處理的細(xì)胞8 h。在Ca2+成像系統(tǒng)中檢查到拉伸刺激誘發(fā)的軟骨細(xì)胞中Ca2+的特性取決于拉伸強(qiáng)度，轉(zhuǎn)染siRNA使Piezo1基因沉默后的細(xì)胞拉伸誘發(fā)的Ca2+變化得到了顯著抑制，這表明拉伸刺激后軟骨細(xì)胞的Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要依賴于Piezo1[57]。但是也有研究認(rèn)為，Piezo1離子通道導(dǎo)致的鈣離子過載導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡[58]。小鼠成骨細(xì)胞敲除Piezo1導(dǎo)致出生后早期骨密度降低、自發(fā)性骨折發(fā)生率增加且影響次生海綿體，體內(nèi)尺骨加載實(shí)驗(yàn)證實(shí)了骨細(xì)胞機(jī)械感覺需要 Piezo1。在軟骨細(xì)胞中Piezo1基因缺失的小鼠和上述成骨細(xì)胞中刪除Piezo1小鼠的表型相似。對原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞刪除Piezo1的小鼠軟骨細(xì)胞相關(guān)基因，如SRY相關(guān)高遷移率組基因9(SRY-related high mobility group-box gene 9，Sox9)和周期蛋白依賴激酶抑制因子1C(cyclin dependent kinase inhibitor 1C，Cdkn1c)發(fā)生變化。ATDC5軟骨細(xì)胞給予Yoda1刺激后可以觀察到Piezo1表達(dá)增加明顯，且流體力刺激顯著增加MC3T3-E1細(xì)胞Piezo1表達(dá)[59]。這些數(shù)據(jù)表明 Piezo1通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)影響軟骨內(nèi)骨化過程，這可能是Piezo1在治療骨代謝疾病的又一重要方向。

4 總結(jié)和展望

機(jī)械負(fù)荷可以增加骨量、上調(diào)骨密度。機(jī)械敏感陽離子通道蛋白Piezo1是連接外界機(jī)械負(fù)荷刺激與哺乳動物體內(nèi)生物信號的重要因子，可以作為骨感受機(jī)械刺激的傳感器，在骨代謝和骨骼重建方面發(fā)揮作用，為研究者繼續(xù)了解機(jī)械負(fù)荷刺激調(diào)控骨代謝和骨重建提出了新的思路，也為未來深入研究機(jī)械力刺激通過Piezo1改善骨科疾病提供了新的發(fā)展空間。