張銳柳海平趙寧李愛強柴喜平

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

外泌體(Exosomes)是由多種細胞分泌的一種細胞外囊泡(EVs)，直徑為40～100 nm，與細胞具有相同的拓撲結(jié)構，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸及糖綴合物，其包含一系列膜相關的高階寡聚蛋白復合物，表現(xiàn)出明顯的分子異質(zhì)性，所具有的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構能夠輕松地與其他細胞的細胞膜融合，可以通過直接接觸、內(nèi)分泌或旁分泌的方式將其內(nèi)含的生物活性物質(zhì)選擇性地傳遞進入靶細胞，實現(xiàn)細胞外基質(zhì)的重塑及細胞間信號分子的傳遞。多項研究發(fā)現(xiàn)這種細胞間囊泡的運輸方式在人類健康和疾病的許多方面發(fā)揮著重要作用，包括發(fā)育、免疫、組織動態(tài)平衡、癌癥和退行性疾病[1-2]。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)不同細胞源性外泌體可以調(diào)節(jié)骨代謝，重建骨平衡，與骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)有著密切的關系[3]。本文意在對不同細胞源性外泌體與骨質(zhì)疏松之間的關系及其治療OP的機制與可行性進行綜述，以期為外泌體在OP的基礎研究與臨床診療中提供參考。

1 外泌體與骨穩(wěn)態(tài)

骨骼是人體的主要支撐框架，具有剛性及自我修復能力，它為軟器官提供保護，為負責造血和脂肪存儲的骨髓提供了穩(wěn)定的環(huán)境[4]。同時，骨組織是一種代謝高度活躍的組織，處于不斷的生理活動中以去除舊的、受傷的骨，并新形成骨取代它，新形成的骨在促進或保持骨強度和適應不斷變化的生物力學方面具有更強的機械性能，健康的骨骼總是處于這種動態(tài)平衡狀態(tài)，隨著年齡的增長，當骨吸收大于骨形成時，這種動態(tài)平衡失調(diào)時就會導致OP等嚴重疾病[5]。而這種動態(tài)平衡即骨穩(wěn)態(tài)主要受成骨細胞(osteocblast，OB)、破骨細胞(osteoclast，OC)、骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)、內(nèi)皮細胞等多種細胞的調(diào)控。

OB是位于骨表面的大型立方體細胞，調(diào)控成骨，促進骨基質(zhì)合成和隨后的礦化；OC是一種來源于單核細胞/巨噬細胞譜系的大型多核細胞，能夠在吸收區(qū)分泌Cl-、H+、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和組織蛋白酶K(CtsK)來降解骨組織[6]；BMSCs是組織工程中最理想的種子細胞，在一定條件下可向成骨細胞定向分化，對于骨穩(wěn)態(tài)的維持至關重要[7]；骨形成與骨微環(huán)境中的血管生成密切相關，而骨微環(huán)境中血管的生成需要多種內(nèi)皮細胞與信號通路的參與[8]，因此內(nèi)皮細胞參與了骨微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持。上述OB、OC、BMSCs及內(nèi)皮細胞相互影響、相互調(diào)節(jié)，進而維持骨穩(wěn)態(tài)，防治OP的發(fā)生。而細胞間信息相互交流的機制尚不清楚，傳統(tǒng)理論認為細胞通過旁分泌途徑分泌相關細胞因子而進行信息交流[9]。而外泌體是大多數(shù)細胞分泌的納米級囊泡，它們被脂質(zhì)雙分子層包裹，并攜帶蛋白質(zhì)、聚糖、脂質(zhì)、DNA、RNA等生物分子，其被其他細胞吸收時，這些生物分子被轉(zhuǎn)移并影響受體細胞的表型，從而發(fā)揮效應[10]。作為細胞間交流和遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運的重要介質(zhì)，近年來多項研究發(fā)現(xiàn)OB、OC、BMSCs及內(nèi)皮細胞等多種細胞分泌的外泌體在維持骨穩(wěn)態(tài)、防治OP方面發(fā)揮了重要的作用。

2 不同細胞源性外泌體與骨質(zhì)疏松

2.1 BMSCs源性外泌體與OP

BMSCs分化方向在骨代謝中扮演著重要的角色，外因及信號處理過程如何調(diào)控其分化方向是目前研究的熱點，外泌體作為干細胞重要的旁分泌形式，可通過信號蛋白、RNA等物質(zhì)調(diào)控BMSCs增殖和分化改善骨質(zhì)疏松[11]。目前有多項研究報道，來源于BMSCs的外泌體(MSC-Exo)具有與BMSCs相似的功能，并且與BMSCs相比，MSC-Exo具有穩(wěn)定性好、易保存、無免疫源性、易獲得、轉(zhuǎn)化方便等優(yōu)點。因此具有上述特性的MSC-Exo可能是改善傳統(tǒng)BMSCs治療OP不足的理想替代品[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs來源的外泌體可通過多種信號通路來影響OP。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是存在于哺乳動物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞外刺激到細胞核的重要信號轉(zhuǎn)導酶[13]。研究表明成骨細胞的基因表達和功能發(fā)揮與MAPK信號通路的刺激有關[14]，Zhao等[12]從大鼠骨髓中分離出MSC，提取MSCs衍生的外泌體(MSC-Exo)，而后將成骨細胞系的hFOB 1.19細胞作為研究對象，設立空白對照組、MSC-Exo干預組、MSC-Exo+JNK基因敲除組，結(jié)果顯示，MSC-Exo干預組細胞存活率及細胞周期明顯高于其他兩組，因此得出結(jié)論，MSC-Exo可通過MAPK信號通路促進hFOB 1.19細胞增殖，從而延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)展。Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)節(jié)骨代謝的重要分子途徑[15]，Wnt信號的激活有助于成骨細胞介導的骨形成的骨量及強度的增加，因此，該通路對成骨細胞增殖及分化至關重要[16]。Zuo等[17]研究發(fā)現(xiàn)MSC-Exo可以減輕輻射誘導的大鼠骨丟失，機制可能與減輕氧化應激反應、加速DNA損傷修復、減少與抑制增殖和細胞衰老相關的蛋白以及通過激活Wnt/β-catenin通路恢復BMSCs成骨和成脂平衡相關。

核酸是外泌體的重要組成成分，包括mRNA、miRNA、lncRNA等[18]。其中miRNA是一類長17～24個核苷酸的非編碼微小RNA[19]，包裹在外泌體中的miRNA能夠被靶細胞攝取與靶mRNA 3’UTR結(jié)合，進而如同內(nèi)源性的miRNA通過沉默靶基因而發(fā)揮其作用[20]。干細胞源性外泌體很大程度上是通過其攜帶的miRNA發(fā)揮成骨作用。Qiu等[21]研究發(fā)現(xiàn)BMSC來源的外泌體miR-150-3p能夠促進OB增殖和分化，機制與上調(diào)Runx2、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix)、堿性磷酸酶(ALP)及骨鈣素相關。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)MSC-Exo通過將miR-935傳遞到OB中抑制信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)，而STAT1沉默則促進了OB和礦化結(jié)節(jié)中的ALP活性，從而抑制骨質(zhì)疏松。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)在MSCs成骨分化過程中，分化晚期細胞分泌的外泌體中miR-31、miR-144和miR-221低表達有助于誘導成骨分化，而分化晚期外泌體中miR-21顯著增加，而miR-21可作用于成骨分化抑制因子Spry1和Sox2，另一方面miR-21可以通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT-GSK3β通路，激活Runx2的表達而促進MSCs的成骨。lncRNA是長度大于200個核苷酸的長鏈非編碼RNA，現(xiàn)已成為MSCs成骨過程中的新型調(diào)節(jié)劑。miR-34c可通過靶向SATB2和Runx2因子及抑制Notch通路中的多種因子影響成骨細胞與破骨細胞，從而在骨穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用[24]。MALAT1是最早鑒定出與人類疾病相關的lncRNA之一[25]，Yang等[26]研究發(fā)現(xiàn)MALAT1通過OPG/RANKL通路調(diào)節(jié)骨溶解，其下調(diào)可抑制破骨細胞活性。Yang等[27]研究發(fā)現(xiàn)miR-34c逆轉(zhuǎn)了MALAT1的作用，SATB2逆轉(zhuǎn)了miR-34c的作用，而BMSCs衍生的外泌體MALAT1通過介導miR-34c/SATB2軸增強了骨質(zhì)疏松小鼠的成骨細胞活性，可減輕骨質(zhì)疏松。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體不僅可以影響MAPK、Wnt/β-catenin等成骨相關信號通路，并且可通過其內(nèi)含的miRNA、lncRNA等物質(zhì)發(fā)揮調(diào)控BMSCs成骨分化的作用，從而減輕骨質(zhì)疏松。

2.2 OB源性外泌體與OP

OB是骨微環(huán)境的重要組成細胞，可通過分泌外泌體參與調(diào)節(jié)成骨-破骨平衡。Ge等[28]對小鼠成骨細胞株MC3T3外泌體進行蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)1 069個蛋白質(zhì)，進行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，生物學過程主要集中在蛋白定位和細胞內(nèi)信號通路，能夠促進MSCs成骨分化的Integrin信號通路和在骨代謝平衡中發(fā)揮重要作用的mTOR信號通路備受關注；而分子功能顯示在骨重塑中起重要作用的Rho GTP酶較為重要，這說明OB衍生的外泌體在成骨過程中發(fā)揮作用。研究[29]發(fā)現(xiàn)礦化前成骨細胞MC3T3-E1分泌的外泌體能夠促進骨髓基質(zhì)細胞(ST2)向成骨細胞分化，機制可能與MC3T3-E1分泌的外泌體改變了ST2細胞miRNA表達，這些改變的miRNA協(xié)同抑制Axin1，上調(diào)β-catenin蛋白，從而激活Wnt/b-catenin途徑，刺激成骨分化。微環(huán)境由細胞外基質(zhì)(ECM)和細胞分泌的外泌體及生長因子組成，Narayanan等[30]研究發(fā)現(xiàn)分化細胞的ECM調(diào)節(jié)干細胞的表型，而它們的外泌體包含控制干細胞分化表型的特異性指導因子(miRNA、RNA、蛋白質(zhì))，在帶有OB外泌體的成骨細胞或成脂細胞外基質(zhì)上分化的hMSCs都顯示出成骨相關基因的表達，因此，在hMSCs譜系分化過程中，外泌體可能會覆蓋ECM介導的指示信號。

另有研究發(fā)現(xiàn)，OB源性外泌體可能與破骨細胞形成相關。Deng等[31]研究表明OB源性外泌體含有RANKL蛋白，并且能夠通過受體配體(RANKL-RANK)將其轉(zhuǎn)移至破骨細胞前體，刺激RANKL-RANK信號傳導，促進破骨細胞形成。研究[32]發(fā)現(xiàn)溶酶體膜蛋白-1陽性的成骨細胞外泌體攜帶了RANKL、骨保護素以及抗酒石酸酸性磷酸酶，從而促進破骨細胞形成。

因此，OB源性外泌體不僅可以加強成骨細胞的分化和礦化，并且含有控制干細胞表型的特異性指導因子，促使干細胞向成骨細胞分化，另一方面，OB源性外泌體與破骨細胞形成相關。而OB和OC之間這種外泌體介導的細胞間通訊可能代表了骨骼建模和重塑的新機制。

2.3 OC源性外泌體與OP

骨吸收由OC介導，OC是目前唯一明確有降解骨質(zhì)功能的細胞，過度活躍的OC導致骨丟失和骨質(zhì)疏松。因此在加強成骨作用的同時，如何調(diào)節(jié)OC的功能在防治OP方面十分重要。Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)OC衍生的外泌體miR-214-3p可以充當細胞間信使以介導OC與OB的通訊，轉(zhuǎn)移至OB以抑制骨形成，基于此，OC中miR-214-3p的治療性抑制可能是逆轉(zhuǎn)已確診的OP的潛在骨合成代謝策略。Yang等[34]研究發(fā)現(xiàn)OC衍生的含有miR-23a-5P的外泌體可通過抑制Runx2和促進YAP1介導的MT1DP來抑制OB分化。成熟OC外泌體可抑制OB內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路，并誘導OB凋亡，促進OP的發(fā)展。Huynh等[35]報道了破骨細胞前體的外泌體有刺激破骨細胞成熟化的作用，然而通過對成熟破骨細胞的培養(yǎng)，卻發(fā)現(xiàn)其分泌的外泌體抑制了破骨細胞生成。因此破骨細胞介導的外泌體的作用可能是雙向的，其中的分子機制對OP的影響尚未明確，尚需進一步探究。

2.4 內(nèi)皮細胞源性外泌體與OP

骨組織具有高度血管化的特點，骨內(nèi)血管灌注不足與OP密切相關。新生血管不但能夠運送氧氣及重要營養(yǎng)物質(zhì)，還可以加速細胞增殖及骨基質(zhì)礦化[36]。研究[37]發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮組細胞衍生的含有miR-126的外泌體，可下調(diào)內(nèi)皮細胞SPRED1基因表達，活化RAF/ERK1/2信號通路，促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管生成。van Balkom等[38]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞釋放的含有miR-214的外泌體通過作用于相鄰內(nèi)皮細胞，可抑制內(nèi)皮細胞凋亡并促進其遷移，促進血管生成。

內(nèi)皮細胞源性外泌體除了可以促進血管生成而在骨再生中發(fā)揮作用外，還可以抑制OC活性，治療骨質(zhì)疏松。Song等[39]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞源性外泌體比OB及BMSCs源性外泌體具有更有效的骨靶向性，內(nèi)皮細胞衍生的外泌體可抑制OC的活性，在去卵巢小鼠OP模型中可抑制骨質(zhì)疏松，對外泌體miRNA測序發(fā)現(xiàn)miR-155可能具有治療OP的潛力。Yang等[40]研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞衍生的外泌體可以通過抑制鐵蛋白依賴性鐵下垂治療糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松癥。但也有研究[41]發(fā)現(xiàn)老年骨質(zhì)疏松患者內(nèi)皮細胞源性外泌體含有miR-31，而miR-31作用于MSCs后成骨分化被抑制。因此內(nèi)皮細胞源性外泌體對成骨和成血管的生理效應尚不清楚，仍有待研究。

3 總結(jié)與展望

OP是一種骨量減低和骨微結(jié)構破壞而易發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病[42]。我國65歲以上人群OP患病率約為32%，由其導致的骨折發(fā)生率高達39%，預計2050年我國由OP引發(fā)的骨折人數(shù)將達599萬，而相應醫(yī)療支出將高達1 745億元，給家庭及社會造成了嚴重的經(jīng)濟負擔[43]。研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機制主要是骨形成與骨吸收呈負平衡，骨重建失衡造成骨丟失[44]。目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物可分為抗吸收調(diào)節(jié)劑和合成代謝藥物，前者包括雌激素、雄激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素和雙膦酸鹽，后者有特立帕肽，但是這些藥物通常會引起嚴重的不良反應。就特立帕肽而言，研究表明，77%服用20 μg的患者和78%服用40 μg的患者出現(xiàn)了關節(jié)痛、肌肉痙攣及疲勞等不良反應；長期使用雌激素會對大腦及子宮產(chǎn)生嚴重的不良反應；而長期降鈣素治療由于降鈣素循環(huán)抗體的產(chǎn)生可導致機體耐受；目前最常用的治療OP 的藥物雙膦酸鹽會出現(xiàn)胃腸道刺激、骨骼和關節(jié)疼痛及下頜骨壞死等并發(fā)癥[45]。因此，開發(fā)具有高骨靶向性和低毒性的藥物勢在必行。

外泌體是細胞間通訊的中心介質(zhì)，通過將蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及RNA傳送至鄰近或遠處靶細胞，形成了一套全新的細胞間信息傳遞系統(tǒng)，通過影響細胞的生理病理狀態(tài)與OP的發(fā)生及進程密切相關。MSC-Exo不僅可以影響MAPK、Wnt/β-catenin等成骨相關信號通路，并且可通過其內(nèi)含的miRNA、lncRNA等物質(zhì)發(fā)揮調(diào)控BMSCs成骨分化的作用，從而減輕骨質(zhì)疏松；OB和OC源性外泌體介導的細胞間通訊可能代表了骨骼建模和重塑的新機制；而內(nèi)皮細胞源性外泌體通過成骨與成血管生理效應可發(fā)揮防治OP的作用。因此不同細胞源性外泌體在OP的發(fā)生及進程中較為重要，研究其作用機制可為外泌體作為新的OP治療策略奠定理論基礎。

外泌體作為防治OP的新策略具有多種優(yōu)勢。與傳統(tǒng)細胞療法相比，外泌體具有較高的安全性[46]，其可避免細胞移植引起的栓子、腫瘤等并發(fā)癥；與生物納米材料相比，外泌體生物相容性較高而細胞毒性更低；并且外泌體因其穿過細胞膜及血腦屏障的能力及可調(diào)節(jié)的靶向效率，成為了遞送藥物及基因的理想載體[47]。但是將外泌體應用于骨質(zhì)疏松的治療還面臨許多難題，例如，如何大量高效地分離提純外泌體以及運輸儲存是一大難題；其次，如何使其準確定位到靶組織和靶細胞是臨床應用面臨的問題[48]。隨著對外泌體研究的不斷深入，將更系統(tǒng)更準確地了解其與靶細胞之間的信號機制，外泌體有望成為防治OP的具有良好前景的治療策略。