尹竺晟，梁新軍

0 引言

熱療作為一種綠色安全的腫瘤治療手段，目前在臨床上常作為放化療的輔助療法，其與抗腫瘤免疫機制的基礎研究越來越受到重視。近年來，隨著眾多熱療技術包括射頻消融、磁熱療、聚焦超聲熱療、腹腔熱灌注治療、納米顆粒介導的熱療等發(fā)展，熱療在臨床上的應用也越來越廣闊?，F(xiàn)將腫瘤熱療與抗腫瘤免疫之間的研究進展作一綜述。

1 熱療抗腫瘤機制

熱療是根據(jù)腫瘤組織與正常組織對溫度的差異應激，對病變部位進行加熱，以殺死腫瘤細胞或阻止其生長的一種治療方法。腫瘤代謝水平普遍較正常組織高，腫瘤血管的異常發(fā)育讓大多數(shù)實體腫瘤組織存在乏氧的情況，在熱療過程中，癌旁組織血流量增加導致腫瘤組織血液供應進一步減少，從而減少了腫瘤所獲得的氧以及營養(yǎng)物質(zhì)，在短時間內(nèi)提高腫瘤糖酵解代謝水平，使酸性代謝產(chǎn)物大量堆積，從而引起腫瘤細胞自噬[1]。根據(jù)溫度高低，熱療可分為發(fā)熱范圍溫度熱療（39℃～40℃）、中溫熱療（熱休克溫度，41℃～43℃）和熱消融（細胞毒性溫度，＞43℃）。發(fā)熱范圍溫度熱療會增加血流量，從而減少缺氧，而更高的溫度則會導致血管損傷，加劇缺氧，也會誘導更直接的腫瘤細胞殺傷[2]。隨著技術的進步，目前新開發(fā)的熱療手段還包括磁性納米粒子熱療、低溫熱療和光熱療法。

熱療也可以直接或間接殺死缺氧細胞。直接殺傷細胞強烈依賴于加熱溫度和加熱時間；溫度越高，加熱時間越長，效果越顯著。一般而言，低于42℃的溫度對細胞幾乎沒有殺傷作用，除非暴露時間較長[3]。如果細胞保持在缺氧或低pH值狀態(tài)下，則若溫度高于42℃，熱療產(chǎn)生的細胞殺傷效果會更加明顯[4]。當溫度低于43℃時，細胞凋亡似乎占主導地位，溫度更高則以細胞壞死居多。高溫可引起DNA雙鏈斷裂，這是由于熱修復蛋白（如DNA聚合酶）的變性和功能障礙，或變性蛋白沉淀在核染色質(zhì)結構上，阻止修復酶到達損傷部位[5]。熱療誘導的蛋白質(zhì)變性也可改變多種依賴核基質(zhì)的功能（如DNA復制、DNA轉錄、信使核糖核酸（mRNA）加工和DNA修復）；因此，由熱療誘導的細胞死亡，通過不同的機制，可以促進抗原的呈遞或釋放，增加將免疫細胞吸引到腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）的信號分子[6]。

2 熱療對免疫微環(huán)境與腫瘤細胞的交互影響

熱療可以提高機體自身抗腫瘤免疫水平，其效果不僅可以直接殺死腫瘤細胞，還可以直接或間接激活機體免疫系統(tǒng)。然而，熱療引起抗腫瘤免疫的具體機制尚不完全清楚，國內(nèi)外已經(jīng)開展了大量研究，并嘗試著從各種視角探討熱療促進免疫反應的可能機制。

2.1 改變腫瘤細胞免疫原性及能量代謝

有數(shù)據(jù)支持大多數(shù)細胞抑制療法在癌癥患者中誘發(fā)繼發(fā)性壞死的觀點，大多數(shù)化療藥物和放射線引起癌細胞凋亡而不是原發(fā)性壞死[7]。而經(jīng)熱療后，大量腫瘤細胞壞死，暴露出新的腫瘤相關抗原，刺激免疫系統(tǒng)，進而引起腫瘤細胞的凋亡和繼發(fā)性壞死。微環(huán)境中“能量元件”的成分改變也能影響腫瘤免疫原性的改變。有研究表明高水平的細胞外ATP在腫瘤部位積聚，TME中這些高水平的細胞外ATP通過P2X7受體抑制腫瘤生長，即通過P2X7-NLRP3炎性小體激活以及在腫瘤細胞和腫瘤血管內(nèi)皮細胞中發(fā)揮P2X7定向的細胞毒性來刺激抗腫瘤免疫反應。熱療能增加細胞膜的膜脂流動性，增加P2X7活性，促進腫瘤細胞死亡，增加腫瘤免疫原性，有利于細胞免疫殺傷腫瘤細胞[8]。

2.2 刺激腫瘤細胞產(chǎn)生熱休克蛋白

腫瘤局部熱療誘導并過表達多種熱休克蛋白（heat shock protein,HSPs），隨后激活免疫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)。熱療時腫瘤被加熱至39℃～43℃，高溫可通過增強周圍TME的氧合和增加腫瘤的血流量，改變腫瘤細胞的病理生理環(huán)境。HSPs在樹突狀細胞的抗原識別中發(fā)揮積極作用，將HSPs結合的抗原多肽轉運到主要組織相容性復合物-1（major histocompatibility complex,MHC-I）分子，觸發(fā)抗原特異性T細胞活化[9]。HSP60（伴侶蛋白）參與抗原依賴的T細胞激活，刺激干擾素-γ分泌和T細胞激活[10]。HSPs在細胞內(nèi)攜帶多種多肽物質(zhì)，可形成HSP-抗原復合物，能被細胞毒性T細胞所識別，并引起特異性免疫反應[11]。

2.3 促進細胞因子的分泌

熱療刺激促炎因子的分泌（如白細胞介素-1、干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α等），可直接殺死腫瘤細胞或進一步活化抗原提呈細胞，并趨化至腫瘤部位[12]。研究表明，發(fā)熱可以控制淋巴細胞的轉運，在小鼠或癌癥患者的核心體溫升高到約39.5℃后，體溫范圍內(nèi)的全身熱療法會導致循環(huán)T細胞短暫下降，白細胞介素-6作為一種熱敏轉運效應因子，控制淋巴細胞和內(nèi)皮細胞的黏附。熱療通過白細胞介素-6傳遞信號直接作用于淋巴細胞，刺激MEK1-ERK1/ERK2信號通路，促進L-選擇素粘附，以及肌動蛋白基礎的細胞骨架、α-肌動蛋白和L-選擇素胞漿尾部之間的分子間相互作用，從而增強L-選擇素非依賴性淋巴細胞的黏附和運輸[13]。

2.4 清除體內(nèi)腫瘤免疫抑制因子

癌細胞、基質(zhì)細胞和免疫細胞分泌的VEGF-D和VEGF-C促進TME淋巴管的發(fā)育，促進腫瘤在遠端器官的轉移性增殖[14]，熱療可抑制VEGF-C/D的分泌釋放，并誘導單核細胞分化為M1型巨噬細胞，促進炎性反應因子的形成[15]，給NK細胞、細胞毒性T細胞提供合適的微環(huán)境。

3 熱療對TME中關鍵免疫細胞的影響

研究表明，適宜溫度的熱療能增強機體抗腫瘤免疫功能，促進白細胞介素-2和腫瘤壞死因子產(chǎn)生，增加局部淋巴細胞的浸潤[16]，激活NK細胞及T細胞。

3.1 熱療與NK細胞

據(jù)報道，免疫細胞暴露在高溫下對各種免疫細胞功能既有刺激作用，也有抑制作用[17]。在40℃以上的溫度下（高于通常在發(fā)熱或運動時達到的生理體溫），NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性同時具有活性增強和抑制的作用[18]。在發(fā)熱范圍內(nèi)的熱應激（39.5℃）增強了人NK細胞對腫瘤靶細胞的細胞毒性，這種作用要求NK細胞的NKG2D受體發(fā)揮功能，當NK和腫瘤細胞靶點都激活時，NK細胞的殺傷能力最強[19]。熱誘導的NK細胞變化導致細胞毒性改變的性質(zhì)尚不清楚。但根據(jù)Milani等的研究，它至少是獨立于MHC-I類/肽復合物的[20]。在經(jīng)IL-2增強的NK細胞細胞毒性過程中，NK細胞與靶細胞之間形成偶聯(lián)物時，激活受體NKG2D聚集在靶細胞接觸部位[21]。為此，Ostberg等研究了溫和的熱應力對NK細胞表面NKG2D定位的影響：NKG2D在NK細胞表面的表達沒有變化，但NKG2D在NK細胞表面的聚集有明顯的短暫增加，NKG2D受體與抗NKG2D抗體交聯(lián)或IL-2激活NK細胞導致類似的聚集[22]。然而NK細胞的激活狀態(tài)可能會影響其對熱應激的敏感度，因為在39.5℃下，IL-2激活的NK細胞沒有表現(xiàn)出熱增強的細胞毒性[23]。激活受體NKG2D的聚集可能與NK細胞的激活狀態(tài)有關，IL-2激活NK細胞后，NKG2D聚集增強，熱療溫度卻不能進一步升高。因此，高溫不會影響IL-2活化的NK細胞[24]。另外，在40℃以上的溫度下觀察到，與未處理的NK細胞相比，多聚胞苷酸激活的NK細胞具有更高的耐熱性[25]。因此，根據(jù)NK細胞的狀態(tài)和不同的激活途徑，它們可能對熱應激有不同的敏感度。

3.2 熱療與T細胞亞群

熱療可誘導免疫原性細胞死亡，導致新抗原的釋放。因此，熱療可以提高CD8+T細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。此外，熱療可以通過促進趨化因子的釋放，將效應T細胞吸引到TME，通過突破血管屏障，也促進了T細胞的浸潤[26]。另外，全身熱水浴減少了外周血B和T細胞的總數(shù)，而CD8+T細胞顯著增加。這表明熱療可以提高身體細胞免疫功能[27]。有體內(nèi)研究顯示，動物暴露于中等溫度熱療極大地增加了L-選擇素和α4β7整合素依賴性淋巴細胞向次級淋巴組織的轉運[28]，導致全身熱療后數(shù)小時淋巴結內(nèi)T細胞數(shù)量增加，這表明合適溫度的熱療可刺激T細胞增殖和募集。另外，T細胞對熱療的反應也取決于不同的微環(huán)境，其調(diào)節(jié)機制極為復雜，體內(nèi)發(fā)熱溫度可能會通過Th2誘導CD4+T細胞應答，但這一結果可能會被微環(huán)境中IL-12的存在和濃度進一步調(diào)節(jié)[29]。同時，在接受全身熱療的患者中，表達α4β7整合素的T細胞減少比外周表達CD5的T細胞數(shù)量減少的程度要小得多，而且只持續(xù)了很短的一段時間[30]，這也表明熱療可抑制T細胞與整合素細胞黏附分子-1相結合，有利于T淋巴細胞在TME的募集，而對成熟的T細胞的功能性影響不大。

4 熱療與免疫治療聯(lián)合的探索

通常情況下，熱消融手術等局部熱療是針對單發(fā)或少發(fā)轉移性疾病的患者進行的。但目前免疫檢查點的發(fā)現(xiàn)以及免疫檢查點抑制劑的開發(fā)為局部進展的腫瘤患者提供了新的視角，越來越多研究表明局部腫瘤治療可以產(chǎn)生全身性的免疫治療療效。根據(jù)TME的免疫狀態(tài)，腫瘤可分為“冷”型和“熱”型，即免疫沙漠表型和免疫炎癥型腫瘤。免疫炎癥型腫瘤，也稱為“熱腫瘤”，其特點是高T細胞浸潤、增加的干擾素-γ信號轉導、程序性死亡受體配體 1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）表達和高腫瘤突變負荷[31]。在免疫沙漠型腫瘤中，腫瘤及其周圍CD8+T淋巴細胞浸潤少，“冷腫瘤”還具有低突變負荷、低MHC-I類表達和低PD-L1表達的特征，而富集免疫抑制細胞群（包括腫瘤相關巨噬細胞、T調(diào)節(jié)細胞和髓源性抑制細胞）。其中“冷”型腫瘤對程序性死亡受體-1（programmed death-1,PD-1）/PD-L1抑制劑的應答率往往較低，原因是T細胞浸潤少，PD-L1表達少，在驅使T細胞進入腫瘤的過程中，有許多因素可以影響T細胞啟動和T細胞歸巢至腫瘤附近，導致抗腫瘤免疫失敗[32]。冷腫瘤由于免疫原性低而對免疫檢查點抑制劑不敏感。熱療通過提供熱休克蛋白的危險信號以及隨后的免疫系統(tǒng)激活來調(diào)節(jié)TME的免疫狀態(tài)。這種免疫調(diào)節(jié)作用不僅使熱療成為一種能夠干預癌癥的治療方法，而且使熱療成為一種可靠的治療方法，它可以創(chuàng)造一個Ⅰ型腫瘤微環(huán)境[33]，即PD-L1的過度表達和腫瘤浸潤淋巴細胞的富集的腫瘤微環(huán)境，作為對免疫檢查點抑制劑增強的補充。另外血清細胞因子分析顯示，在41℃高熱30分鐘可誘導瘤內(nèi)炎性細胞因子和趨化因子增加，增強T細胞的轉運，有利于淋巴細胞浸潤到腫瘤微環(huán)境并攻擊免疫級聯(lián)反應中的實體瘤[34]。熱療可能在局部進展或廣泛轉移的腫瘤患者中提高免疫治療療效以及改善預后。

有研究發(fā)現(xiàn)不同熱療方式聯(lián)合其他療法可以增強抗腫瘤免疫效果。目前已有使用酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼聯(lián)合射頻消融治療肝細胞癌的研究。射頻消融導致腫瘤特異性抗原原位釋放且引起T淋巴細胞中PD-1表達上調(diào)，這與CD8+T淋巴細胞的耗竭有關。舒尼替尼通過抑制肝細胞生長因子抑制腫瘤T淋巴細胞中PD-1表達的上調(diào)。舒尼替尼對VEGF的抑制也促進了樹突狀細胞活化并抑制了腫瘤血管生成。聯(lián)合治療最終導致CD8+T淋巴細胞和樹突狀細胞顯著增加以及T調(diào)節(jié)細胞減少，從而克服了單一療法的缺點，舒尼替尼聯(lián)合射頻消融通過觸發(fā)抗腫瘤免疫反應來治療肝細胞癌[35]。Duffy等的一項研究也顯示[36]，在射頻消融和CTLA-4阻斷劑聯(lián)合應用治療晚期肝細胞癌的患者中發(fā)現(xiàn)，將伊匹木單抗與熱療相結合的治療方案是可行的，且在消融或栓塞區(qū)域之外產(chǎn)生了客觀的腫瘤反應，表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)CD8+T細胞的積累和T細胞的克隆性降低。在另一項射頻消融聯(lián)合PD-1抑制劑治療復發(fā)性肝癌時也顯示出了良好的安全性[37]，結果顯示PD-1抑制劑與射頻消融聯(lián)合治療可改善復發(fā)性肝細胞癌患者的1年PFS和OS。

另外，納米粒子介導的光熱療法（photothermal therapy,PTT）已開發(fā)為一種新的癌癥治療策略，它利用腫瘤中積累的光吸收劑吸收的光能產(chǎn)生的熱量來消融腫瘤。Chen等的研究發(fā)現(xiàn)，在免疫佐劑納米粒子存在下，PTT治療后腫瘤消融在原位產(chǎn)生的腫瘤相關抗原可以顯示出類似疫苗的功能，結合檢查點阻斷顯示出強大的抗腫瘤作用[38]。還有研究者更是開發(fā)了一種光熱輔助免疫治療（symbiotic mild photothermal-assisted immunotherapy,SMPAI）策略，將近紅外（NIR）光熱劑IR820和程序性死亡配體1抗體（anti-PD-L1）加載到具有凝膠—溶膠（熱可逆）相變特性的脂質(zhì)凝膠庫中：通過控制凝膠強度實現(xiàn)讓納米材料在不同腫瘤中停留時間一致；可以通過調(diào)整載藥量來控制暴露劑量，以保持最低有效劑量的焦點濃度；可通過控制凝膠-溶膠相變來調(diào)節(jié)藥物釋放量和釋放時間，實現(xiàn)持續(xù)的抗腫瘤作用。并在小鼠模型中驗證了SMPAI策略可放大T細胞免疫反應并使TIL水平相對較低的“冷”腫瘤的對免疫治療敏感，同時誘導幼稚T細胞分化為CD8+T細胞，有助于抑制遠處腫瘤的生長并防止腫瘤轉移[39]。

磁熱療（MHT）因具有良好的療效、無創(chuàng)性、對正常組織的損傷最小、成本低、組織滲透性好，受到越來越多的關注。在過去的20年中，已經(jīng)成功地對膠質(zhì)母細胞瘤和前列腺癌患者進行了向瘤內(nèi)富集磁性納米顆粒的第一階段和第二階段臨床研究[40-41]。對前列腺癌患者的Ⅰ期臨床研究證明了磁熱療的可行性，但在腫瘤中實現(xiàn)和維持熱療的場強和頻率并非易事，磁熱療后雖然PSA下降，但單一療法的療效范圍和持續(xù)時間有限。由于熱療的療效在很大程度上受到所達到的溫度和保持時間的影響，未來的研究必須通過密切檢測腫瘤溫度來確保熱療有效。

目前的研究中，精確控制溫和的PTT溫度不僅對調(diào)節(jié)藥物釋放很重要，而且對免疫缺陷腫瘤的致敏性以及增強抗PD-L1治療的作用也至關重要。因此，在未來的研究中，必須在體內(nèi)建立更完整的溫度-效應關系以優(yōu)化治療效果。

5 總結和展望

本文簡述了熱療引起腫瘤患者免疫系統(tǒng)改變的主要途徑，并對抗腫瘤免疫的主要組成部分NK細胞和T細胞群的研究進展及免疫治療跟熱療聯(lián)合的基礎理論和部分臨床應用做了簡要的總結。

目前，熱療已廣泛應用于臨床實踐，在多種惡性腫瘤的臨床試驗中取得了良好的療效。許多研究者傾向于探索熱療與其他療法的聯(lián)合治療。未來熱療與其他療法相結合時，應當關注最佳溫度、持續(xù)時間、順序和時間間隔等更精確的知識；利用通過增加更多抗癌治療提供的交叉協(xié)同作用，以獲得新的多模態(tài)治療組合；開發(fā)能夠更精確溫度控制的新加熱策略，使熱療得到最佳利用。熱療聯(lián)合免疫治療是一種值得關注的新治療模式，未來需要更多的探索。