馬詩淳， 彭成慧， 鄧 宇， 張 輝， 楊毅

(1.農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所， 成都 610041； 2國(guó)家農(nóng)業(yè)微生物雙流觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站， 成都 610000； 3.三亞中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家南繁研究院， 海南 三亞 572024； 4.四川大學(xué)， 成都 610065)

熱袍菌門(Thermotogota)是一類廣泛分布于高溫、厭氧環(huán)境的細(xì)菌。比較基因組研究發(fā)現(xiàn)，熱袍菌門與古菌存在水平基因轉(zhuǎn)移，具有大量的(24%)古菌同源蛋白，在細(xì)菌域的系統(tǒng)進(jìn)化樹上呈一深度分支，可能是極端嗜熱細(xì)菌的共同祖先[1]。趨異/趨同進(jìn)化分析揭示熱袍菌基因組中具有磷酸二肌醇生物合成相關(guān)的基因，嗜溫的mesotoga起源于熱袍菌目。同時(shí)，它具有多種高度熱穩(wěn)定的水解酶編碼基因，能夠利用多聚糖、單糖產(chǎn)生氫氣[2]。因此，熱袍菌目一直是研究生命進(jìn)化、生物質(zhì)降解、生物制氫重要模式菌種[3-5]。本文總結(jié)了熱袍菌門在分類學(xué)、環(huán)境適應(yīng)機(jī)制、生理生化功能等方面的研究進(jìn)展。

1 熱袍菌門的系統(tǒng)分類地位

自Huber[6]等分離到Thermotogamaritima建立熱袍菌目(Thermotogales)以來，這類生長(zhǎng)溫度高達(dá)90℃的極端嗜熱細(xì)菌在生命進(jìn)化和能源利用領(lǐng)域備受關(guān)注。2001年，Reysenbach等提出熱袍菌綱(Thermotogae)[7]。30多年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)從海洋地?zé)釁^(qū)、陸地?zé)崛陀筒氐壬撤蛛x到熱袍菌目新物種。隨著物種數(shù)量的增加和基因組數(shù)據(jù)的積累，2015年，Bhandari[8]等對(duì)熱袍菌綱進(jìn)行了重新分類，將其劃分為Thermotogales, Kosmotogales 和Petrotogales 3個(gè)目。2021年，Aharon Oren和George M Garrity提出熱袍菌門(Thermotogota)[9]。目前，熱袍菌門包含4目(新增Mesoaciditogales)[10]，5科(Thermatogaceae, Fervidobacteriaceae, Kosmotogaceae, Petrotogaceae和 Mesoaciditogaceae)科，13屬(Thermotoga，F(xiàn)ervidobacterium，Geotoga，Petrotoga，Marinitoga，Thermosipho，Kosmotoga，Oceantoga，Mesotoga，Pseudothermotoga,Tepiditoga,Athalassotoga,Mesoaciditoga)53種(見表1)。

2 熱袍菌門的生理特征

熱袍菌門成員的生長(zhǎng)溫度范圍廣(25℃～95℃)，包含極端嗜熱，嗜熱，嗜溫物種(見表1)。除Thermotogales(Tt.affectus)只能夠在嗜熱條件下生長(zhǎng)，其他物種均可在中溫和高溫條件下生長(zhǎng)，但僅M.prima的最適生長(zhǎng)溫度為中溫(37℃)。所有物種均不形成芽孢，革蘭氏染色陰性(D.tunisiensis為陽性)；K.shengliensis的細(xì)胞呈球形，其他物種均為桿狀細(xì)胞，外具獨(dú)特的鞘狀結(jié)構(gòu)包被。Mesoaciditogales是熱袍菌門唯一的中度嗜酸物種，最適生長(zhǎng)pH值 5.5～6.0。

表1 有效發(fā)表的熱袍菌門物種及生理特性

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

3 熱袍菌門的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制

3.1 中溫?zé)崤劬陌l(fā)現(xiàn)及其溫度適應(yīng)機(jī)制

長(zhǎng)期以來，人們對(duì)熱袍菌的認(rèn)識(shí)都是基于其極端嗜熱或嗜熱的特性。但是，隨著微生物分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展，在多種中溫的地上和地下厭氧生境中檢測(cè)到了與熱袍菌目16S rRNA基因高度相似的基因序列，如多氯聯(lián)苯的富集物(30℃)，以及降解鄰氯苯酚、多環(huán)芳烴、鄰苯二甲酸二甲酯的微生物群落的海港沉積物的富集物、厭氧消化污泥(34℃)[54, 56-57]。這一類可在中溫環(huán)境中生長(zhǎng)代謝的熱袍菌目成員被稱為棲溫袍菌(“mesotoga”)[58]。

嗜溫的熱袍菌門M1族系普遍存在于中溫、富含烴類的油藏及油污土等厭氧生境，與分離自高溫油藏、可營(yíng)中溫生長(zhǎng)的K.olearia16S rRNA相似性最高。通過構(gòu)建Fosmid基因文庫，Nesbo[59]等提出“M1起源于棲息在高溫油藏的物種，是適應(yīng)油藏溫度降低的結(jié)果”的假說。2012年，該團(tuán)隊(duì)分離了熱袍菌門的首個(gè)嗜溫物種M.prima，基因組分析發(fā)現(xiàn)該物種通過水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)從厚壁菌門、古菌等物種中獲得了32%的蛋白質(zhì)編碼基因，其中25%來自于梭菌目的中溫物種。分析不同培養(yǎng)溫度下的K.olearia表型及基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)細(xì)胞膜的組成及代謝模式具有明顯影響。高溫條件下(65℃)能量和碳水化合物代謝相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)溫度降低至40℃時(shí)，冷應(yīng)激蛋白Csp、核糖體蛋白、參與氨基酸代謝和不飽和脂肪酸合成的基因上調(diào)表達(dá)，并且細(xì)胞膜脂肪酸的組成更復(fù)雜，不飽和脂肪酸(9-十八碳烯酸)的含量增加。此外，K.olearia還通過復(fù)制和/或HGT等方式增加Csp等基因的拷貝數(shù)，以應(yīng)對(duì)低溫生長(zhǎng)。但K.olearia適應(yīng)高溫生長(zhǎng)的機(jī)制尚不清楚[60-61]。

3.2 熱袍菌門耐受氧脅迫的機(jī)制

通常，O2在氧化還原酶(如氫酶)的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化成H2O2和ROS，H2O2和ROS與蛋白質(zhì)(參與物質(zhì)與能量代謝)的Fe-S簇等活性位點(diǎn)相互作用，使其喪失生物活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝系統(tǒng)崩潰[69]。在Clostridiumacetobutylicum等厭氧微生物中，Suf和Nif系統(tǒng)在FeⅡ吸收基因的誘導(dǎo)下表達(dá)，維持Fe-S簇的生物合成，以抵御O2對(duì)細(xì)胞的毒害[70-71]。利用差異蛋白質(zhì)組分析，僅發(fā)現(xiàn)Tt.maritimaSuf C在氧脅迫下上調(diào)表達(dá)[68]。

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在Fe(Ⅱ)(包括損傷的Fe-S簇)時(shí)，O2的氧化產(chǎn)物H2O2可以與其發(fā)生Fenton化學(xué)反應(yīng)(Fe(Ⅱ)+H2O2→Fe(Ⅲ)+OH﹒+OH-)，產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性的OH。OH與DNA分子非選擇性結(jié)合，引起基因突變甚至細(xì)胞凋亡(致死突變)[72]。厭氧微生物主要通過誘導(dǎo)表達(dá)NTP焦磷酸轉(zhuǎn)移酶(pyrophosphohydrolases, MutT1)、DNA結(jié)合鐵蛋白類似物(Dps)，核糖核苷還原酶(ribonucleotide reductase, NrdA)等核苷酸合成酶保護(hù)DNA與RNA[73]。迄今為止，僅發(fā)現(xiàn)Tt.maritima通過鐵蛋白亞基的解聚活動(dòng)保護(hù)DNA[74]，還沒有熱袍菌在氧脅迫下參與DNA保護(hù)和修復(fù)的基因被報(bào)道。

在0.5%的氧濃度下，Tt.maritima能夠以73.6μmoles O2/g蛋白·min速率消耗O2，這一結(jié)論不僅徹底改變了人們對(duì)熱袍菌目不能以氧作為末端電子受體的認(rèn)識(shí)[66]，還為Van等人的假設(shè)提供了部分證據(jù)。結(jié)合比較基因組分析，通過電化學(xué)分析和體外驗(yàn)證，Le Fourn小組提出了T.maritime的O2及ROS消耗系統(tǒng)——氧還原鏈[75](見圖1)。氧還原鏈?zhǔn)且环NNAD(P)H依賴性的O2及ROS的解毒系統(tǒng)，由成簇排列的NADH氧化還原酶(NADH oxidoreductase, NRO)、紅素氧還蛋白(rubredoxin, Rd)和FprA(flavo-diiron protein)組成。當(dāng)環(huán)境中存在O2時(shí)，Rd作為電子傳遞的媒介，將NRO的輔酶NADH所攜帶的電子傳遞給FprA，再由FprA將O2還原成H2O，消耗O2；但是當(dāng)環(huán)境中存在ROS時(shí)，Rd將電子分別分配給具有過氧化氫酶活性的Rbr和具有過氧化物酶活性的neelaredoxin(Nlr)，清除ROS。當(dāng)環(huán)境中氧當(dāng)環(huán)境中出現(xiàn)ROS積累時(shí)，Tt.maritima通過交替表達(dá)兩組不同的過氧化物酶系編碼基因應(yīng)對(duì)不同的氧化壓力。ROS濃度較低時(shí)，烷基過氧化物還原酶(alkyl hydroperoxide reductase, Ahp)/硫醇過氧化物酶(thioredoxin-dependent thiol peroxidase，Bcp2)酶系編碼基因表達(dá)上調(diào)；ROS濃度較高時(shí)，Bcp1(即Ahp C)/Rbr氧化還原酶編碼基因表達(dá)上調(diào)。Couturier[76]等人證實(shí)上述蛋白具有過巰基依賴型氧化物蛋白活性。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Tt.maritima氧還原鏈中的5個(gè)酶是通過水平基因轉(zhuǎn)移從Thermococcales中獲得，以適應(yīng)環(huán)境變化。但是，在后來的進(jìn)化中，部分基因已在一些物種中(如Kosmotoga，Petrotoga,Thermosipho)丟失。

圖1 Tt. maritime NAD(P)H依賴性的氧及氧自由基的解毒系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖

4 熱袍菌門的代謝功能

4.1 糖類水解

熱袍菌門物種營(yíng)有機(jī)異養(yǎng)生長(zhǎng)，可利用的底物主要包括多種戊糖、己糖、二糖和多糖，以及酵母粉、乙酸鹽、甲醇和果膠等(見表1)。近年來發(fā)現(xiàn)，熱袍菌門含有大量的底物特異性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以及多種α-和β-糖苷水解酶(GH)，用于水解各類碳水化合物[77-78]。Tt.maritima基因組中，參與水解單糖和多聚糖的基因占已知基因的7 %[79]。與其他厭氧微生物相比，Tt.maritima不產(chǎn)生纖維小體等大分子聚合蛋白，主要利用各種胞外和胞內(nèi)水解酶完成多聚糖的降解(見表2)。F.pennavorans和F.islandicum還具有羽毛角蛋白降解能力，分別分泌嗜熱堿性絲氨酸蛋白酶fervidolysin和金屬蛋白酶[20, 80]。目前，已成功表達(dá)了果膠酶、淀粉酶、木聚糖酶、角蛋白酶等生物酶[5, 81-84]，其最適酶促反應(yīng)溫度均高于80℃，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用潛力[78, 85-86]。

表2 Tt. maritima基因組中注釋到的α-和β-糖苷酶

為了提高生物酶的熱穩(wěn)定性和活性，已將定點(diǎn)突變、固定化等技術(shù)成功應(yīng)用于木聚糖酶、鼠李糖酶的研究[83, 115-116]。通過定向改造Tt.maritimeMSB8的木聚糖酶 XYN10B，將其在100℃的半衰期活性提高了3.3～3.5倍[116]。采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，α-L-鼠李糖苷酶的催化效率提高了200余倍[117]。將Tt.neapolitana的內(nèi)切-1,4-β-半乳糖酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶與內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶 (XynA)，內(nèi)切-1,4-β-甘露糖酶(ManB/Man5A)和β-葡萄糖苷酶 (GghA)聯(lián)合作用，可用于大麥秸稈和玉米麩皮半纖維素水解[118]。T.maritima中，利用半乳甘露聚糖的功能酶(如甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-乳糖酶)可降解用做油井和氣井壓裂液的瓜膠。T.neapolitana和T.maritima的木糖異構(gòu)酶可以在高溫發(fā)酵條件下提高果糖濃度[119]。

4.2 發(fā)酵產(chǎn)氫代謝

基因組分析發(fā)現(xiàn)，在Tt.maritima中，絕大多數(shù)葡萄糖可通過EM途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸，但仍有13%的葡萄糖通過產(chǎn)能水平較低的ED途徑進(jìn)行代謝[119-120]，最終產(chǎn)生氫氣、乙酸和乳酸等代謝產(chǎn)物。其中，氫氣合成由[FeFe]-氫酶介導(dǎo)，[FeFe]-氫酶耦合吸能的NADH氧化產(chǎn)氫反應(yīng)和放能的還原性鐵氧還蛋白(Fd)氧化產(chǎn)氫反應(yīng)，從而推動(dòng)產(chǎn)氫代謝[121]。在產(chǎn)乙酸代謝途徑中，磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酸激酶不需要消耗還原力，可以避免NADH的再氧化，同時(shí)產(chǎn)生還原性Fd和ATP。然而，在乳酸發(fā)酵途徑中，乳酸脫氫酶需要消耗糖酵解過程中產(chǎn)生的還原力NADH，與氫氣合成競(jìng)爭(zhēng)還原力。因此，乙酸發(fā)酵更有利于H2的合成。

除了Mesotoga，幾乎所有的熱袍菌門物種都可以利用各種簡(jiǎn)單和復(fù)雜的糖類發(fā)酵產(chǎn)氫。其中，熱袍菌目的氫氣產(chǎn)量接近理論極限值(4 mol H2/mol葡萄糖)；Marinitoga具有良好的氫耐受性，嗜壓細(xì)菌Mn.piezophila的最適氫分壓高達(dá)40 KPa，Mn.Hydrogenitolerans和Mn.okinawensis的生長(zhǎng)速率不受氫分壓的抑制[42-43]。

研究發(fā)現(xiàn)，干擾NADH和還原性鐵氧還蛋白的因素均會(huì)影響氫氣產(chǎn)率，如氫分壓、曝氣、氧氣、氮源、硫源等。Tt.neapolitana和Tt.maritima中，較低的氫分壓有利于乙酸積累；氫分壓增加過程中，葡萄糖異化作用由乙酸通路向消耗NADH的乳酸合成通路轉(zhuǎn)換；當(dāng)氫分壓為607 mbar，底物的消耗率、生物量、氫氣產(chǎn)量均會(huì)降低[3, 122]。Tt.neapolitana發(fā)酵過程中進(jìn)行曝氣(N2)可降低氫分壓，將氫氣產(chǎn)量提高一倍以上[65]。在微氧條件下，F(xiàn).pennavorans,Pseudot.elfii和Tt.neapolitana的氫氣產(chǎn)量超過了理論產(chǎn)氣量，目前機(jī)制尚不清楚[64, 123]。補(bǔ)加適量有機(jī)氮源(酵母粉>2 g·L-1)時(shí)，Tt.neapolitana和Tt.maritima的氫氣產(chǎn)量提高30%左右[124]。硫單質(zhì)、巰基或亞鐵等可作為熱袍菌的電子受體，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，同時(shí)可滿足氫酶等氧化還原酶合成鐵硫簇的硫素需求，因此，補(bǔ)加半胱氨酸、硫化鈉等可將氫氣產(chǎn)量提高2倍[122]。

Tt.neapolitana和Tt.maritima可發(fā)酵多種單糖和多聚糖、有較高的氫氣產(chǎn)率，Tt.neapolitana的氫氣產(chǎn)率可達(dá)3.46～3.85 mol H2·mol-1葡萄糖[125]。目前已對(duì)其利用纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、廢紙漿等產(chǎn)氫的工藝進(jìn)行了許多的探索和研究。Tt.maritima發(fā)酵果蔬垃圾的氫氣產(chǎn)量為3.36 mol H2·mol-1己糖和209 L H2·kg-1VS，產(chǎn)氫速率為28.82 mmol·h-1L-1[126]。

4.3 嗜二氧化碳乳酸發(fā)酵

在Tt.neapolitana的糖酵解產(chǎn)氫過程中，當(dāng)有充足的CO2或碳酸氫鈉時(shí)，部分外源CO2可與乙酰輔酶A偶聯(lián)，產(chǎn)生乳酸(見圖2)，這一乳酸和氫氣合成過程被命名為嗜二氧化碳乳酸發(fā)酵(Capnophilic Lactic Fermentation，CLF)[127]。由于其他細(xì)胞過程可提供額外還原力維持NADH依賴特性代謝途徑，理論上，CLF可將糖完全轉(zhuǎn)化為乳酸(或其他丙酮酸衍生物)，乳酸產(chǎn)量高于暗發(fā)酵的理論產(chǎn)量，且不影響氫氣合成。在富含CO2的條件下，Tt.neapolitanasubsp.capnolactica是熱袍菌目中唯一一個(gè)乳酸和氫氣產(chǎn)量均增加的物種[128]。轉(zhuǎn)錄組研究證實(shí)，CO2誘導(dǎo)了糖酵解和ED途徑等核心碳代謝的重排及激活機(jī)制，從而增加維持CLF所必需的還原力NADH[129]。

CLF可以回收糖酵解產(chǎn)生的乙酰輔酶A和外源CO2，是一種極具吸引力的生物技術(shù)。Pradhan[130]等構(gòu)建了Tt.neapolitana的CLF模型，用于指導(dǎo)改善其生物產(chǎn)氫和乳酸發(fā)酵性能。同時(shí)，遺傳改造、電刺激等方法對(duì)Tt.neapolitana產(chǎn)乳酸代謝也具有一定的促進(jìn)作用[131-132]。Esercizio等人通過乙酰輔酶A合成酶的異源表達(dá)，將Tt.neapolitanaDSM33003的乳酸產(chǎn)量增加1.7倍，但產(chǎn)氫代謝受損。目前已證實(shí)，Tt.neapolitana可用于淀粉的CLF和生物制氫，乳酸和H2產(chǎn)量分別為0.88±0.39～0.33±0.11 mol乳酸/mol葡萄糖eq.和3.34(±0.17)～2.79(±0.17)mol H2/mol葡萄糖eq.[133]。

注:葡萄糖的乙酸發(fā)酵(黑色箭頭)產(chǎn)生H2和乙酸鹽。反應(yīng)器頂空CO2濃度的增加決定乙酰輔酶A向乳酸鹽(紅色箭頭)的回收利用，而不會(huì)影響氫氣合成。LDH，乳酸脫氫酶；PROR，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶。

5 展望

熱袍菌門的發(fā)現(xiàn)研究已有30多年歷史，生物信息學(xué)的發(fā)展有效推動(dòng)了熱袍菌門在系統(tǒng)分類地位、環(huán)境適應(yīng)特性、生理代謝機(jī)制、功能基因資源挖掘等方面的研究進(jìn)展。獲得了一批嗜熱、嗜溫的新物種，在轉(zhuǎn)錄水平揭示了其對(duì)溫度、氧脅迫的應(yīng)答機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了一系列可用于纖維素、半纖維素、角蛋白等復(fù)雜生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的嗜熱/極端嗜熱水解酶，評(píng)估了菌種在生物制氫、乳酸發(fā)酵中的應(yīng)用潛力。熱袍菌門成員都來自于從高溫環(huán)境，具有多樣的嗜熱或極端嗜熱代謝特性，不僅可以作為重要的工業(yè)酶來源，也是碳捕獲、可再生能源和高附加值化學(xué)基產(chǎn)品生產(chǎn)的潛在菌種資源。

但是，我們對(duì)熱袍菌門的認(rèn)識(shí)仍十分有限。熱袍菌門廣泛存在于富含碳?xì)浠衔锏挠筒丨h(huán)境，目前獲得的物種均為碳水化合物水解菌和硫/鐵還原細(xì)菌，尚未發(fā)現(xiàn)烴類代謝功能，該類群在油藏中的生態(tài)功能及與其他物種的互作關(guān)系尚不清楚。其次，目前熱袍菌門的遺傳代謝機(jī)制研究都是在體外進(jìn)行，遺傳操作技術(shù)幾乎處于空白，無法開展體內(nèi)驗(yàn)證研究。另外，CLF代謝的能量平衡、乙酸/乳酸平衡等機(jī)制有待深入研究，以指導(dǎo)菌種定向改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化，從而提高固碳產(chǎn)氫效率。最后，多聚糖的水解通常由多種水解酶協(xié)同作用，需深入研究熱袍菌不同水解酶的結(jié)構(gòu)和功能，指導(dǎo)生物酶的定向改造，提高酶活性和穩(wěn)定性；同時(shí)，結(jié)合多酶協(xié)同催化體系的輔助設(shè)計(jì)，構(gòu)建纖維素、幾丁質(zhì)、果膠等復(fù)雜多聚糖的酶解系統(tǒng)，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用提供物質(zhì)和技術(shù)保障。