馬詩淳， 彭成慧， 鄧 宇， 張 輝， 楊毅

(1.農業(yè)部沼氣科學研究所， 成都 610041； 2國家農業(yè)微生物雙流觀測實驗站， 成都 610000； 3.三亞中國農業(yè)科學院國家南繁研究院， 海南 三亞 572024； 4.四川大學， 成都 610065)

熱袍菌門(Thermotogota)是一類廣泛分布于高溫、厭氧環(huán)境的細菌。比較基因組研究發(fā)現，熱袍菌門與古菌存在水平基因轉移，具有大量的(24%)古菌同源蛋白，在細菌域的系統進化樹上呈一深度分支，可能是極端嗜熱細菌的共同祖先[1]。趨異/趨同進化分析揭示熱袍菌基因組中具有磷酸二肌醇生物合成相關的基因，嗜溫的mesotoga起源于熱袍菌目。同時，它具有多種高度熱穩(wěn)定的水解酶編碼基因，能夠利用多聚糖、單糖產生氫氣[2]。因此，熱袍菌目一直是研究生命進化、生物質降解、生物制氫重要模式菌種[3-5]。本文總結了熱袍菌門在分類學、環(huán)境適應機制、生理生化功能等方面的研究進展。

1 熱袍菌門的系統分類地位

自Huber[6]等分離到Thermotogamaritima建立熱袍菌目(Thermotogales)以來，這類生長溫度高達90℃的極端嗜熱細菌在生命進化和能源利用領域備受關注。2001年，Reysenbach等提出熱袍菌綱(Thermotogae)[7]。30多年來，國內外學者陸續(xù)從海洋地熱區(qū)、陸地熱泉和油藏等生境分離到熱袍菌目新物種。隨著物種數量的增加和基因組數據的積累，2015年，Bhandari[8]等對熱袍菌綱進行了重新分類，將其劃分為Thermotogales, Kosmotogales 和Petrotogales 3個目。2021年，Aharon Oren和George M Garrity提出熱袍菌門(Thermotogota)[9]。目前，熱袍菌門包含4目(新增Mesoaciditogales)[10]，5科(Thermatogaceae, Fervidobacteriaceae, Kosmotogaceae, Petrotogaceae和 Mesoaciditogaceae)科，13屬(Thermotoga，Fervidobacterium，Geotoga，Petrotoga，Marinitoga，Thermosipho，Kosmotoga，Oceantoga，Mesotoga，Pseudothermotoga,Tepiditoga,Athalassotoga,Mesoaciditoga)53種(見表1)。

2 熱袍菌門的生理特征

熱袍菌門成員的生長溫度范圍廣(25℃～95℃)，包含極端嗜熱，嗜熱，嗜溫物種(見表1)。除Thermotogales(Tt.affectus)只能夠在嗜熱條件下生長，其他物種均可在中溫和高溫條件下生長，但僅M.prima的最適生長溫度為中溫(37℃)。所有物種均不形成芽孢，革蘭氏染色陰性(D.tunisiensis為陽性)；K.shengliensis的細胞呈球形，其他物種均為桿狀細胞，外具獨特的鞘狀結構包被。Mesoaciditogales是熱袍菌門唯一的中度嗜酸物種，最適生長pH值 5.5～6.0。

表1 有效發(fā)表的熱袍菌門物種及生理特性

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

3 熱袍菌門的環(huán)境適應機制

3.1 中溫熱袍菌的發(fā)現及其溫度適應機制

長期以來，人們對熱袍菌的認識都是基于其極端嗜熱或嗜熱的特性。但是，隨著微生物分子生態(tài)學的發(fā)展，在多種中溫的地上和地下厭氧生境中檢測到了與熱袍菌目16S rRNA基因高度相似的基因序列，如多氯聯苯的富集物(30℃)，以及降解鄰氯苯酚、多環(huán)芳烴、鄰苯二甲酸二甲酯的微生物群落的海港沉積物的富集物、厭氧消化污泥(34℃)[54, 56-57]。這一類可在中溫環(huán)境中生長代謝的熱袍菌目成員被稱為棲溫袍菌(“mesotoga”)[58]。

嗜溫的熱袍菌門M1族系普遍存在于中溫、富含烴類的油藏及油污土等厭氧生境，與分離自高溫油藏、可營中溫生長的K.olearia16S rRNA相似性最高。通過構建Fosmid基因文庫，Nesbo[59]等提出“M1起源于棲息在高溫油藏的物種，是適應油藏溫度降低的結果”的假說。2012年，該團隊分離了熱袍菌門的首個嗜溫物種M.prima，基因組分析發(fā)現該物種通過水平基因轉移(HGT)從厚壁菌門、古菌等物種中獲得了32%的蛋白質編碼基因，其中25%來自于梭菌目的中溫物種。分析不同培養(yǎng)溫度下的K.olearia表型及基因表達情況發(fā)現，溫度對細胞膜的組成及代謝模式具有明顯影響。高溫條件下(65℃)能量和碳水化合物代謝相關的基因上調表達，當培養(yǎng)溫度降低至40℃時，冷應激蛋白Csp、核糖體蛋白、參與氨基酸代謝和不飽和脂肪酸合成的基因上調表達，并且細胞膜脂肪酸的組成更復雜，不飽和脂肪酸(9-十八碳烯酸)的含量增加。此外，K.olearia還通過復制和/或HGT等方式增加Csp等基因的拷貝數，以應對低溫生長。但K.olearia適應高溫生長的機制尚不清楚[60-61]。

3.2 熱袍菌門耐受氧脅迫的機制

通常，O2在氧化還原酶(如氫酶)的介導下轉化成H2O2和ROS，H2O2和ROS與蛋白質(參與物質與能量代謝)的Fe-S簇等活性位點相互作用，使其喪失生物活性，從而導致細胞代謝系統崩潰[69]。在Clostridiumacetobutylicum等厭氧微生物中，Suf和Nif系統在FeⅡ吸收基因的誘導下表達，維持Fe-S簇的生物合成，以抵御O2對細胞的毒害[70-71]。利用差異蛋白質組分析，僅發(fā)現Tt.maritimaSuf C在氧脅迫下上調表達[68]。

當細胞內存在Fe(Ⅱ)(包括損傷的Fe-S簇)時，O2的氧化產物H2O2可以與其發(fā)生Fenton化學反應(Fe(Ⅱ)+H2O2→Fe(Ⅲ)+OH﹒+OH-)，產生具有強氧化性的OH。OH與DNA分子非選擇性結合，引起基因突變甚至細胞凋亡(致死突變)[72]。厭氧微生物主要通過誘導表達NTP焦磷酸轉移酶(pyrophosphohydrolases, MutT1)、DNA結合鐵蛋白類似物(Dps)，核糖核苷還原酶(ribonucleotide reductase, NrdA)等核苷酸合成酶保護DNA與RNA[73]。迄今為止，僅發(fā)現Tt.maritima通過鐵蛋白亞基的解聚活動保護DNA[74]，還沒有熱袍菌在氧脅迫下參與DNA保護和修復的基因被報道。

在0.5%的氧濃度下，Tt.maritima能夠以73.6μmoles O2/g蛋白·min速率消耗O2，這一結論不僅徹底改變了人們對熱袍菌目不能以氧作為末端電子受體的認識[66]，還為Van等人的假設提供了部分證據。結合比較基因組分析，通過電化學分析和體外驗證，Le Fourn小組提出了T.maritime的O2及ROS消耗系統——氧還原鏈[75](見圖1)。氧還原鏈是一種NAD(P)H依賴性的O2及ROS的解毒系統，由成簇排列的NADH氧化還原酶(NADH oxidoreductase, NRO)、紅素氧還蛋白(rubredoxin, Rd)和FprA(flavo-diiron protein)組成。當環(huán)境中存在O2時，Rd作為電子傳遞的媒介，將NRO的輔酶NADH所攜帶的電子傳遞給FprA，再由FprA將O2還原成H2O，消耗O2；但是當環(huán)境中存在ROS時，Rd將電子分別分配給具有過氧化氫酶活性的Rbr和具有過氧化物酶活性的neelaredoxin(Nlr)，清除ROS。當環(huán)境中氧當環(huán)境中出現ROS積累時，Tt.maritima通過交替表達兩組不同的過氧化物酶系編碼基因應對不同的氧化壓力。ROS濃度較低時，烷基過氧化物還原酶(alkyl hydroperoxide reductase, Ahp)/硫醇過氧化物酶(thioredoxin-dependent thiol peroxidase，Bcp2)酶系編碼基因表達上調；ROS濃度較高時，Bcp1(即Ahp C)/Rbr氧化還原酶編碼基因表達上調。Couturier[76]等人證實上述蛋白具有過巰基依賴型氧化物蛋白活性。系統發(fā)育學研究發(fā)現，Tt.maritima氧還原鏈中的5個酶是通過水平基因轉移從Thermococcales中獲得，以適應環(huán)境變化。但是，在后來的進化中，部分基因已在一些物種中(如Kosmotoga，Petrotoga,Thermosipho)丟失。

圖1 Tt. maritime NAD(P)H依賴性的氧及氧自由基的解毒系統的結構示意圖

4 熱袍菌門的代謝功能

4.1 糖類水解

熱袍菌門物種營有機異養(yǎng)生長，可利用的底物主要包括多種戊糖、己糖、二糖和多糖，以及酵母粉、乙酸鹽、甲醇和果膠等(見表1)。近年來發(fā)現，熱袍菌門含有大量的底物特異性ABC轉運蛋白，以及多種α-和β-糖苷水解酶(GH)，用于水解各類碳水化合物[77-78]。Tt.maritima基因組中，參與水解單糖和多聚糖的基因占已知基因的7 %[79]。與其他厭氧微生物相比，Tt.maritima不產生纖維小體等大分子聚合蛋白，主要利用各種胞外和胞內水解酶完成多聚糖的降解(見表2)。F.pennavorans和F.islandicum還具有羽毛角蛋白降解能力，分別分泌嗜熱堿性絲氨酸蛋白酶fervidolysin和金屬蛋白酶[20, 80]。目前，已成功表達了果膠酶、淀粉酶、木聚糖酶、角蛋白酶等生物酶[5, 81-84]，其最適酶促反應溫度均高于80℃，熱穩(wěn)定性強，具有潛在的工業(yè)應用潛力[78, 85-86]。

表2 Tt. maritima基因組中注釋到的α-和β-糖苷酶

為了提高生物酶的熱穩(wěn)定性和活性，已將定點突變、固定化等技術成功應用于木聚糖酶、鼠李糖酶的研究[83, 115-116]。通過定向改造Tt.maritimeMSB8的木聚糖酶 XYN10B，將其在100℃的半衰期活性提高了3.3～3.5倍[116]。采用計算機輔助設計，α-L-鼠李糖苷酶的催化效率提高了200余倍[117]。將Tt.neapolitana的內切-1,4-β-半乳糖酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶與內切-1,4-β-木聚糖酶 (XynA)，內切-1,4-β-甘露糖酶(ManB/Man5A)和β-葡萄糖苷酶 (GghA)聯合作用，可用于大麥秸稈和玉米麩皮半纖維素水解[118]。T.maritima中，利用半乳甘露聚糖的功能酶(如甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-乳糖酶)可降解用做油井和氣井壓裂液的瓜膠。T.neapolitana和T.maritima的木糖異構酶可以在高溫發(fā)酵條件下提高果糖濃度[119]。

4.2 發(fā)酵產氫代謝

基因組分析發(fā)現，在Tt.maritima中，絕大多數葡萄糖可通過EM途徑轉化為丙酮酸，但仍有13%的葡萄糖通過產能水平較低的ED途徑進行代謝[119-120]，最終產生氫氣、乙酸和乳酸等代謝產物。其中，氫氣合成由[FeFe]-氫酶介導，[FeFe]-氫酶耦合吸能的NADH氧化產氫反應和放能的還原性鐵氧還蛋白(Fd)氧化產氫反應，從而推動產氫代謝[121]。在產乙酸代謝途徑中，磷酸乙酰轉移酶和乙酸激酶不需要消耗還原力，可以避免NADH的再氧化，同時產生還原性Fd和ATP。然而，在乳酸發(fā)酵途徑中，乳酸脫氫酶需要消耗糖酵解過程中產生的還原力NADH，與氫氣合成競爭還原力。因此，乙酸發(fā)酵更有利于H2的合成。

除了Mesotoga，幾乎所有的熱袍菌門物種都可以利用各種簡單和復雜的糖類發(fā)酵產氫。其中，熱袍菌目的氫氣產量接近理論極限值(4 mol H2/mol葡萄糖)；Marinitoga具有良好的氫耐受性，嗜壓細菌Mn.piezophila的最適氫分壓高達40 KPa，Mn.Hydrogenitolerans和Mn.okinawensis的生長速率不受氫分壓的抑制[42-43]。

研究發(fā)現，干擾NADH和還原性鐵氧還蛋白的因素均會影響氫氣產率，如氫分壓、曝氣、氧氣、氮源、硫源等。Tt.neapolitana和Tt.maritima中，較低的氫分壓有利于乙酸積累；氫分壓增加過程中，葡萄糖異化作用由乙酸通路向消耗NADH的乳酸合成通路轉換；當氫分壓為607 mbar，底物的消耗率、生物量、氫氣產量均會降低[3, 122]。Tt.neapolitana發(fā)酵過程中進行曝氣(N2)可降低氫分壓，將氫氣產量提高一倍以上[65]。在微氧條件下，F.pennavorans,Pseudot.elfii和Tt.neapolitana的氫氣產量超過了理論產氣量，目前機制尚不清楚[64, 123]。補加適量有機氮源(酵母粉>2 g·L-1)時，Tt.neapolitana和Tt.maritima的氫氣產量提高30%左右[124]。硫單質、巰基或亞鐵等可作為熱袍菌的電子受體，促進菌體生長，同時可滿足氫酶等氧化還原酶合成鐵硫簇的硫素需求，因此，補加半胱氨酸、硫化鈉等可將氫氣產量提高2倍[122]。

Tt.neapolitana和Tt.maritima可發(fā)酵多種單糖和多聚糖、有較高的氫氣產率，Tt.neapolitana的氫氣產率可達3.46～3.85 mol H2·mol-1葡萄糖[125]。目前已對其利用纖維素、淀粉、蛋白質、廢紙漿等產氫的工藝進行了許多的探索和研究。Tt.maritima發(fā)酵果蔬垃圾的氫氣產量為3.36 mol H2·mol-1己糖和209 L H2·kg-1VS，產氫速率為28.82 mmol·h-1L-1[126]。

4.3 嗜二氧化碳乳酸發(fā)酵

在Tt.neapolitana的糖酵解產氫過程中，當有充足的CO2或碳酸氫鈉時，部分外源CO2可與乙酰輔酶A偶聯，產生乳酸(見圖2)，這一乳酸和氫氣合成過程被命名為嗜二氧化碳乳酸發(fā)酵(Capnophilic Lactic Fermentation，CLF)[127]。由于其他細胞過程可提供額外還原力維持NADH依賴特性代謝途徑，理論上，CLF可將糖完全轉化為乳酸(或其他丙酮酸衍生物)，乳酸產量高于暗發(fā)酵的理論產量，且不影響氫氣合成。在富含CO2的條件下，Tt.neapolitanasubsp.capnolactica是熱袍菌目中唯一一個乳酸和氫氣產量均增加的物種[128]。轉錄組研究證實，CO2誘導了糖酵解和ED途徑等核心碳代謝的重排及激活機制，從而增加維持CLF所必需的還原力NADH[129]。

CLF可以回收糖酵解產生的乙酰輔酶A和外源CO2，是一種極具吸引力的生物技術。Pradhan[130]等構建了Tt.neapolitana的CLF模型，用于指導改善其生物產氫和乳酸發(fā)酵性能。同時，遺傳改造、電刺激等方法對Tt.neapolitana產乳酸代謝也具有一定的促進作用[131-132]。Esercizio等人通過乙酰輔酶A合成酶的異源表達，將Tt.neapolitanaDSM33003的乳酸產量增加1.7倍，但產氫代謝受損。目前已證實，Tt.neapolitana可用于淀粉的CLF和生物制氫，乳酸和H2產量分別為0.88±0.39～0.33±0.11 mol乳酸/mol葡萄糖eq.和3.34(±0.17)～2.79(±0.17)mol H2/mol葡萄糖eq.[133]。

注:葡萄糖的乙酸發(fā)酵(黑色箭頭)產生H2和乙酸鹽。反應器頂空CO2濃度的增加決定乙酰輔酶A向乳酸鹽(紅色箭頭)的回收利用，而不會影響氫氣合成。LDH，乳酸脫氫酶；PROR，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶。

5 展望

熱袍菌門的發(fā)現研究已有30多年歷史，生物信息學的發(fā)展有效推動了熱袍菌門在系統分類地位、環(huán)境適應特性、生理代謝機制、功能基因資源挖掘等方面的研究進展。獲得了一批嗜熱、嗜溫的新物種，在轉錄水平揭示了其對溫度、氧脅迫的應答機制，發(fā)現了一系列可用于纖維素、半纖維素、角蛋白等復雜生物質轉化的嗜熱/極端嗜熱水解酶，評估了菌種在生物制氫、乳酸發(fā)酵中的應用潛力。熱袍菌門成員都來自于從高溫環(huán)境，具有多樣的嗜熱或極端嗜熱代謝特性，不僅可以作為重要的工業(yè)酶來源，也是碳捕獲、可再生能源和高附加值化學基產品生產的潛在菌種資源。

但是，我們對熱袍菌門的認識仍十分有限。熱袍菌門廣泛存在于富含碳氫化合物的油藏環(huán)境，目前獲得的物種均為碳水化合物水解菌和硫/鐵還原細菌，尚未發(fā)現烴類代謝功能，該類群在油藏中的生態(tài)功能及與其他物種的互作關系尚不清楚。其次，目前熱袍菌門的遺傳代謝機制研究都是在體外進行，遺傳操作技術幾乎處于空白，無法開展體內驗證研究。另外，CLF代謝的能量平衡、乙酸/乳酸平衡等機制有待深入研究，以指導菌種定向改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化，從而提高固碳產氫效率。最后，多聚糖的水解通常由多種水解酶協同作用，需深入研究熱袍菌不同水解酶的結構和功能，指導生物酶的定向改造，提高酶活性和穩(wěn)定性；同時，結合多酶協同催化體系的輔助設計，構建纖維素、幾丁質、果膠等復雜多聚糖的酶解系統，為實現工業(yè)化應用提供物質和技術保障。