王金樂(lè)，朱 星，李祥平，蓉 夏，愛(ài) 丹，陳斌斌，孫宏迪，謝炳壽*

0 引言

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一種比較常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。通常情況下，MM患者骨髓漿細(xì)胞異常增生，并伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈(M蛋白)過(guò)度生成[1]。MM患者早期無(wú)明顯癥狀，隨著時(shí)間的推移，逐漸出現(xiàn)貧血、溶骨性損害、高鈣血癥、腎臟損傷、感染等[2-3]。卡非佐米(Carfilzomib，CFZ)是臨床用于治療多發(fā)性骨髓瘤的第2代蛋白酶體抑制劑，主要抑制20S蛋白酶體的糜蛋白酶[4]。相較第1代蛋白酶體抑制劑，CFZ不可逆共價(jià)結(jié)合蛋白酶體的催化β5亞組和免疫蛋白酶體β5i(LMP7)亞組，具有更好的藥效，但CFZ應(yīng)用一段時(shí)間后仍然會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥[5-6]。因此，如何解決MM對(duì)CFZ耐藥具有重要臨床意義。

野生型P53誘導(dǎo)的磷酸酶1(Wild type p53-induced phosphatase 1，Wip1 )是由PPM1D基因編碼的一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶[7]。Wip1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并與化療耐藥有關(guān)。研究顯示，Wip1基因沉默可增強(qiáng)人結(jié)腸癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[8]。還有研究顯示，miRNA-16 通過(guò)靶向Wip1和Bcl-2使耐藥乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感[9]。但在MM中，Wip1是否參與介導(dǎo)CFZ耐藥尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。本研究以MM細(xì)胞RPMI 8226作為研究對(duì)象，轉(zhuǎn)染法過(guò)表達(dá)Wip1，觀察Wip1在MM對(duì)CFZ耐藥中的作用并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床治療多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞耐藥提供理論支持。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226購(gòu)自北納生物/河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。

1.2 試劑 RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、5×蛋白上樣緩沖液、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上海碧云天公司；Wip1過(guò)表達(dá)試劑盒購(gòu)自上海吉瑪生物公司；Wip1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司；P-gp抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；GAPDH、山羊抗鼠IgG/PE二抗、山羊抗鼠IgG-HRP二抗、山羊抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)自上海愛(ài)必信公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海銳賽生物；ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Allegra 64R 高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及電源(美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品)；E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品)；MF53-N倒置熒光顯微鏡(廣州明美光電公司產(chǎn)品)；Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司產(chǎn)品)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226以90% RPMI-1640+10% FBS+1%青-鏈霉素制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法過(guò)表達(dá)Wip1 使用包含Wip1基因的質(zhì)粒 pEX-3載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的RPMI 8226細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日，將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒溶于200 μl RPMI-1640培養(yǎng)基中，同時(shí)制備2份含5% lipo2000的RPMI-1640培養(yǎng)基各200 μl。將含質(zhì)粒的培養(yǎng)基與含lipo2000的培養(yǎng)基混合放置20 min。取出細(xì)胞，PBS洗后加入2 ml無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，將混合液分別加入各孔中。轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞設(shè)為Wip1組，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞設(shè)為NC組，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞設(shè)為Control組。轉(zhuǎn)染8 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含10%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以蛋白印記實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Wip1蛋白表達(dá)。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的Control組、NC組及Wip1組的RPMI 8226細(xì)胞，以6 000個(gè)/孔接種于96孔板中。次日，以0.001、0.01、0.1、1、100 μM CFZ處理細(xì)胞48 h，同時(shí)以溶劑(DMSO)處理細(xì)胞設(shè)為對(duì)照孔。各處理組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。48 h時(shí)取出細(xì)胞，將提前融化的MTT以20 μl/孔加入各孔細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出細(xì)胞，慢慢吸取培養(yǎng)液，各孔加入100 μl DMSO，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集Control組、NC組及Wip1組的RPMI 8226細(xì)胞，1 200轉(zhuǎn)/min離心4 min，用PBS重懸細(xì)胞，1 200轉(zhuǎn)/min離心4 min。棄去上清，加入1×binding buffer重懸細(xì)胞，1 200轉(zhuǎn)/min離心4 min，去除上清，重復(fù)該步驟1次。各加入100 μl 1×binding buffer重懸各組細(xì)胞，各加入5 μl AnnexinⅤ和PI染色液，混勻后避光孵育15 min。將細(xì)胞懸液以1 200轉(zhuǎn)/min離心4 min，棄去上清液，加入500 μl PBS重懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.5 蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞Wip1和P-gp蛋白表達(dá)水平 將Control組、NC組及Wip1組的細(xì)胞取出，收集各細(xì)胞于5 ml離心管中，1 200轉(zhuǎn)/min離心4 min，棄去上清，再次1 200轉(zhuǎn)/min離心4 min，棄去上清，盡量吸干水分，加入80 μl RIPA細(xì)胞裂解液。將細(xì)胞置于冰上裂解10 min，后收集于1.5 ml EP管于超低溫離心機(jī)以12 000轉(zhuǎn)/min離心20 min。收集上清液，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，以蛋白上樣緩沖液制備蛋白樣品。蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，而后將凝膠上分離的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉2 h。PVDF膜于4 ℃孵育GAPDH(1∶2 000)，Wip1(1∶1 000)和P-gp(1∶1 000)抗體過(guò)夜。次日吸出一抗，TBST洗3遍，常溫孵育抗兔/鼠IgG-HRP二抗1 h。TBST洗3遍，PVDF膜用ECL發(fā)光液于凝膠成像儀下曝光。Wip1和P-gp蛋白表達(dá)以GAPDH作為內(nèi)參，并以Control組作為對(duì)照進(jìn)行歸一化處理。

2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P-gp蛋白表達(dá) 在六孔板中放入無(wú)菌蓋玻片，將Control組、NC組及Wip1組的細(xì)胞各以2×105個(gè)/孔接種于六孔板中。次日，向六孔板中加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用PBS輕輕洗去固定液，加入山羊血清封閉30 min，吸水紙吸去封閉液。將蓋玻片細(xì)胞面向上放在載玻片上，滴加P-gp抗體(1∶100)。載玻片置于濕盒中，于4 ℃孵育過(guò)夜。第2天，PBST洗去一抗，滴加熒光二抗(1∶50)孵育1 h，PBST輕輕清洗。而后滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑孵育5 min，于熒光顯微鏡下拍照觀察。

3 結(jié)果

3.1 Wip1蛋白在Wip1過(guò)表達(dá)RPMI 8226細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) 蛋白印記結(jié)果顯示，Control組和NC組的Wip1蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。與NC組相比，Wip1組Wip1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，提示W(wǎng)ip1過(guò)表達(dá)RPMI 8226細(xì)胞構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

圖1 Wip1過(guò)表達(dá)RPMI 8226細(xì)胞驗(yàn)證(n=3)

3.2 Wip1過(guò)表達(dá)增強(qiáng)RPMI 8226細(xì)胞抵抗CFZ MTT結(jié)果顯示，Control組和NC組RPMI 8226細(xì)胞增殖曲線相類似，無(wú)明顯差異。與NC組相比，Wip1組在0.01～100 μM CFZ處理后細(xì)胞增殖率均顯著升高(P<0.01)。經(jīng)計(jì)算，CFZ對(duì)Control組、NC組及Wip1組細(xì)胞的IC50分別為(1.08±0.09)μM、(1.10±0.11)μM、(10.25±1.23)μM。與NC組相比，Wip1組細(xì)胞IC50顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

3.3 Wip1過(guò)表達(dá)抵抗CFZ誘導(dǎo)的RPMI 8226細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Control+CFZ組、NC+CFZ組、Wip1+CFZ組細(xì)胞凋亡率分別為39.26%±3.59%、40.21%±4.16%、16.26%±2.21%。Control+CFZ組和NC+CFZ組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NC+CFZ組相比，Wip1+CFZ組細(xì)胞凋亡顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖2 CFZ處理后各組細(xì)胞的增殖率變化(n=6)

圖3 CFZ處理后各組細(xì)胞凋亡的代表圖(n=3)

3.4 Wip1過(guò)表達(dá)對(duì)P-gp蛋白表達(dá)的影響 蛋白印記結(jié)果顯示，Control組和NC組間P-gp蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。與NC組相比，Wip1組P-gp蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)變化(n=3)

3.5 Wip1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)P-gp蛋白表達(dá)上調(diào) 免疫熒光結(jié)果顯示，Control組、NC組及Wip1組P-gp熒光強(qiáng)度分別為23.1±2.8、25.2±3.3、303.5±26.7。Control組和NC組細(xì)胞P-gp熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異。與NC組相比，Wip1組細(xì)胞P-gp熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組細(xì)胞P-gp蛋白熒光變化(100×，n=3)

4 討論

CFZ作為第2代蛋白酶體抑制劑，對(duì)MM擁有較好的療效。但CFZ治療一段時(shí)間后，MM患者依然會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥，最終導(dǎo)致治療失敗。因此，如何解決MM對(duì)CFZ耐藥具有重要的臨床意義。

Wip1作為一種應(yīng)激反應(yīng)性磷酸酶，在應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。Wip1最初被確定為基因毒性應(yīng)激后p53誘導(dǎo)的基因[7,10]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Wip1不僅是p53的靶標(biāo)，還與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(如雌激素受體-α和NF-κB)之間存在相互作用[7,10]。Wip1還能通過(guò)使p38 MAPK和ATM等蛋白質(zhì)去磷酸化和失活來(lái)抑制應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制衰老、細(xì)胞凋亡、DNA 修復(fù)和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[7,10]。

目前研究已證實(shí)，Wip1在多種惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)并發(fā)揮促癌作用。研究顯示，Wip1通過(guò)抑制非小細(xì)胞肺癌p38 MAPK 從而促進(jìn)癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的維持[11]。還有研究顯示，Wip1能與KPNA2協(xié)同通過(guò)p53依賴性方式調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖和遷移[12]。研究報(bào)道，Wip1可能通過(guò)調(diào)節(jié)P53和P16蛋白表達(dá)參與腎癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程[13]。最近的研究顯示，Wip1在肺癌和乳腺癌化療耐藥中發(fā)揮作用，可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗[8-9,14]。本研究以MM細(xì)胞RPMI 8226作為研究對(duì)象，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法成功過(guò)表達(dá)Wip1。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Wip1過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)RPMI 8226細(xì)胞抵抗CFZ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制和凋亡。提示W(wǎng)ip1可能參與RPMI 8226細(xì)胞CFZ耐藥。

P-糖蛋白(P-gp)是一種分子量170 KD的跨膜糖蛋白，為ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族中重要的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體。通常情況下，為了降低藥物對(duì)細(xì)胞的損傷，P-gp與藥物結(jié)合，在ATP供能的條件下將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出胞外，從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。本研究蛋白印記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RPMI 8226細(xì)胞外源性過(guò)表達(dá)Wip1能夠明顯誘導(dǎo)P-gp蛋白表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)也得到了類似結(jié)果。提示W(wǎng)ip1參與RPMI 8226細(xì)胞CFZ耐藥可能與上調(diào)P-gp蛋白表達(dá)有關(guān)。

耐藥作為惡性腫瘤臨床治療的攻堅(jiān)難題，一直沒(méi)有得到理想解決。P-gp在過(guò)去幾十年的研究中一直被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞耐藥的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，Wip1作為上游調(diào)控蛋白可誘導(dǎo)P-gp蛋白表達(dá)，進(jìn)而參與MM細(xì)胞CFZ耐藥。因此，針對(duì)Wip1進(jìn)行干預(yù)，可能是解決MM細(xì)胞CFZ耐藥的潛在方法。