韋飛雪，李小菊，熊斯斯，廖云芳，陳 敏 （八加一藥業(yè)股份有限公司, 廣西 桂林 541000）

純陽正氣膠囊為中藥復(fù)方制劑[藥品批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20205003]，由廣藿香、姜半夏、土木香、陳皮、丁香、肉桂、蒼術(shù)、白術(shù)、茯苓、花椒等十七味中藥組成，具有溫中散寒的功效，用于暑天感寒受濕，腹痛吐瀉，胸隔脹滿，頭痛惡寒，肢體酸重。其處方來源《醫(yī)學(xué)薪傳·祠鶴亭集方》和《中藥成方配本》，方中肉桂辛、甘、大熱，為治寒凝要藥，活性成分桂皮醛可抗?jié)儭⒖咕?、抗炎[1]；丁香辛溫，能治冷氣腹痛，活性成分丁香酚可抗菌、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛[2]；廣藿香辛而微溫，能化濕解暑、和胃止嘔，活性成分百秋李醇可抗炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)胃腸道[3]；蒼術(shù)及白術(shù)甘、苦、溫，能燥濕健胃、祛濕健脾止瀉，活性成分白術(shù)內(nèi)酯類、蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮可調(diào)節(jié)胃腸道及抗炎[4-5]；土木香辛、苦、溫，能健脾和胃、行氣止痛，活性成分土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯可抗菌及鎮(zhèn)痛[6]；半夏及陳皮燥濕和胃，理氣和中[7-8]。其制備工藝中包含揮發(fā)油的提取，主要是將廣藿香、姜半夏、土木香、丁香、肉桂、蒼術(shù)、白術(shù)、花椒經(jīng)水蒸氣蒸餾提取而得，內(nèi)含成品的主要指標(biāo)桂皮醛、丁香酚及多種功效成分如百秋李醇、蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯等。之前的工藝質(zhì)控環(huán)節(jié)并未對該處方中的揮發(fā)油進(jìn)行質(zhì)量控制，中間體的質(zhì)控體系尚不完善，為進(jìn)一步提升中間體及成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文建立了純陽正氣膠囊揮發(fā)油的特征圖譜，并對其主要成分桂皮醛和丁香酚進(jìn)行了含量測定，從定性和定量兩方面控制復(fù)方中的揮發(fā)油成分。

1 材料與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890B 氣相色譜儀，含自動進(jìn)樣器、FID檢測器（美國，Agilent 公司）；XS205DU 型電子天平（d=0.01mg，梅特勒-托利多）；ML204T 型分析天平（d=0.1mg，梅特勒-托利多）；Goodsee-10 型薄層色譜成像儀（上海科哲生化科技有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

純陽正氣膠囊揮發(fā)油（標(biāo)記為S1 至S15，本公司自制）；百秋李醇（批號：110 772-201 909）、丁香酚（批號：110 725-201 917）、桂皮醛（批號：110 710-202 022）、檸檬烯（批號：100 470-201 503）、蒼術(shù)素（批號：111 924-201 806）、土木香內(nèi)酯（批號：110 760-201 811）、異土木香內(nèi)酯（批號：110 761-201 806）等對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；乙醇、石油醚（30～60 ℃）、乙酸乙酯、冰醋酸等試劑均為分析純；硅膠G 薄層板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 特征圖譜的建立與評價(jià)[9-12]

2.1.1 色譜條件

Agilent DB-624（60 m×0.25 mm，1.4 μm）毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度280 ℃，F(xiàn)ID 檢測器溫度280 ℃；載氣為高純氮?dú)?；進(jìn)樣量1 μl；分流比5:1；程序升溫：初始溫度100 ℃，保持20 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至160 ℃，保持25 min，再以每分鐘5 ℃的速率升溫至240 ℃，保持45 min。

2.1.2 溶液的制備

（1）對照品溶液：取檸檬烯、桂皮醛、丁香酚、百秋李醇、蒼術(shù)素、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加乙醇分別制成每1 ml 含1mg 的溶液，即得。

（2）供試品溶液：取本品0.2 g，精密稱定，加乙醇制成每1 ml 含20 mg 的溶液，即得。

（3）陰性溶液：按照純陽正氣膠囊揮發(fā)油提取方法分別制備缺少廣藿香、姜半夏、土木香、丁香、肉桂、蒼術(shù)、白術(shù)、花椒的陰性樣品。取陰性樣品按供試品溶液的制備方法制備陰性溶液。

2.1.3 共有峰的歸屬及特征圖譜的建立

按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件依法測定15 批純陽正氣膠囊揮發(fā)油樣品，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2 012.130 723 版本），以S1 為參照圖譜，按中位數(shù)計(jì)算，進(jìn)行共有峰標(biāo)識，共獲得19 個(gè)峰，見圖1。將陰性樣品與純陽正氣膠囊揮發(fā)油樣品的氣相圖譜進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)峰1～10 及峰16 主要來自花椒；峰11 來自肉桂；峰12、13、14 來自丁香；峰15 來自廣藿香；峰17 來自蒼術(shù)；峰18、19 來自土木香，見圖2。經(jīng)GC-MS 測定[13-18]，NIST質(zhì)譜譜庫檢索以及對照溶液分析，共指認(rèn)了7 個(gè)成分，分別為檸檬烯、桂皮醛、丁香酚、百秋李醇、蒼術(shù)素、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯，見圖3。結(jié)合純陽正氣膠囊揮發(fā)油中功效成分及峰高、峰形等參數(shù)，選取了9 個(gè)特征峰建立特征圖譜，見圖4。以丁香酚參照峰（S 峰），參照《中國藥典》（2020 年版）相關(guān)品種關(guān)于特征圖譜的規(guī)定，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間，見表1，結(jié)果表明9 個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間均在±5%以內(nèi)，符合特征圖譜要求。

圖1 15 批純陽正氣膠囊揮發(fā)油特征圖譜中共有峰標(biāo)識

圖2 純陽正氣膠囊揮發(fā)油特征圖譜中共有峰歸屬

圖3 純陽正氣膠囊揮發(fā)油特征圖譜中共有峰指認(rèn)

圖4 純陽正氣膠囊揮發(fā)油特征圖譜

2.2 桂皮醛與丁香酚的含量測定[19-20]

2.2.1 色譜條件

Agilent DB-624（60 m×0.25 mm，1.4 μm）毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度280 ℃，F(xiàn)ID 檢測器溫度280 ℃；載氣為高純氮?dú)猓贿M(jìn)樣量1 μl；分流比10:1；程序升溫：初始溫度170 ℃，保持30 min，以每分鐘20 ℃的速率升溫至220 ℃，保持27 min。

2.2.2 溶液的制備

（1）對照品溶液：取桂皮醛、丁香酚對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 ml 含1 mg、6 mg 的溶液，即得。

（2）供試品溶液：取本品0.1 g，精密稱定，加乙醇制成每1 ml 含10 mg 的溶液，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對照品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，桂皮醛、丁香酚的保留時(shí)間為21.053、26.492 min，兩者峰面積的RSD（n=5）均<2%，理論板數(shù)按丁香酚峰計(jì)算均>10 000，見圖5。

圖5 系統(tǒng)適用性圖譜

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取桂皮醛、丁香酚對照品溶液適量，采用逐級稀釋法加乙醇制成含桂皮醛0.522、0.782、1.043、1.304、1.565 mg/ml，含丁香酚3.308、4.051、6.076、7.089、9.115 mg/ml 的混合線性溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以桂皮醛、丁香酚溶液濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得桂皮醛和丁香酚的回歸方程分別為：Y=1 482.5X+18.445（r=0.999 4） ；Y=1 383.6X+57.04（r=0.999 7），表明桂皮醛在0.522～1.565 mg/ml、丁香酚在3.038～9.115 mg/ml 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 檢測限與定量限

當(dāng)信噪比為3 時(shí)，測得桂皮醛、丁香酚的檢測限為0.7、1.1μg/ml；當(dāng)信噪比為10 時(shí)，測得桂皮醛、丁香酚的定量限為2.6、3.8 μg/ml。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果桂皮醛平均含量為8.38%，RSD 為0.5%（n=6）；丁香酚平均含量為55.88%，RSD 為0.5%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果桂皮醛、丁香酚峰面積的RSD（n=8）分別為1.0%、1.1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批樣品9 份，每份約50 mg，精密稱定，每份精密加入桂皮醛、丁香酚對照品溶液適量，配制成低、中、高3 個(gè)不同濃度的回收率溶液，每個(gè)濃度3 份，按供試品溶液的制備方法操作，分別精密吸取 1μl 注入氣相色譜儀進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果桂皮醛、丁香酚的平均回收率（n=9）分別為97.1%、97.3%；RSD（n=9）分別為1.5%、1.4%。結(jié)果見表2。

表2 純陽正氣膠囊揮發(fā)油加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 樣品含量測定

分別取6 批不同批號的純陽正氣膠囊揮發(fā)油樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，樣品測定結(jié)果見表3。

表3 純陽正氣膠囊揮發(fā)油含量測定結(jié)果

3 討論

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，對生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)的揮發(fā)油、浸膏等中間體的質(zhì)量控制在很大程度上會影響終產(chǎn)品制劑的質(zhì)量以及生產(chǎn)效率，因此對中間體的質(zhì)量控制方法既要準(zhǔn)確、可行，又要簡單、快速。中藥特征圖譜作為系統(tǒng)全面的質(zhì)量評價(jià)體系，是復(fù)方制劑物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制的最佳途徑[21-22]。本文對來自于小試和中試的15 批揮發(fā)油樣品進(jìn)行了氣相色譜分析，通過與揮發(fā)油陰性對照色譜的對比研究，對各色譜成分進(jìn)行了歸屬，其中花椒、丁香、土木香、肉桂、廣藿香及蒼術(shù)均有相應(yīng)的色譜峰，但未見姜半夏及白術(shù)的相關(guān)成分，推測姜半夏可能是由于揮發(fā)油量相對較小或是受其他成分影響未能檢出，白術(shù)及蒼術(shù)揮發(fā)油中的蒼術(shù)酮在薄層色譜中可檢出，但相對不穩(wěn)定[23]，后續(xù)會進(jìn)一步探索。綜合色譜峰指認(rèn)結(jié)果以及峰形、峰高等因素[24]，最終確定了9 個(gè)峰作為純陽正氣膠囊揮發(fā)油特征譜的特征峰，15 批揮發(fā)油的特征圖中利用面積歸一化法得9 個(gè)特征峰面積占比均在90%以上，相似度均在0.9～1.0 之間，說明揮發(fā)油的制備工藝穩(wěn)定。

本文建立的氣相特征譜可從整體上對純陽正氣膠囊揮發(fā)油進(jìn)行控制，根據(jù)成品的功能主治及指標(biāo)成分[24]對桂皮醛和丁香酚進(jìn)行含量測定，可從定量基礎(chǔ)上更準(zhǔn)確地反映揮發(fā)油成分的存在情況，故本實(shí)驗(yàn)建立的氣相特征圖譜和揮發(fā)油的含量測定方法可分別作為純陽正氣膠囊揮發(fā)油的質(zhì)量控制方法，同時(shí)也為后續(xù)進(jìn)一步提升純陽正氣膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了有效依據(jù)。