袁梓珂，劉明林，杜 娟，姚茹冰 （海軍軍醫(yī)大學：. 基礎醫(yī)學院； . 中醫(yī)系, 上海 200433）

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，以對稱性多關(guān)節(jié)滑膜炎為主要臨床表現(xiàn)，呈慢性、進行性及侵襲性，病情逐漸加重，最終可出現(xiàn)殘疾，甚至累及臟器和神經(jīng)系統(tǒng)而危及生命。目前RA 發(fā)病機制尚不明確，治療主要是非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、改善病情抗風濕藥及生物制劑等對癥治療或改善病情治療，但存在不同程度的療效限制、治療費用高或長期應用副作用較大等問題。昆仙膠囊作為“九五”國家中醫(yī)藥重點科技攻關(guān)項目成果，由昆明山海棠、枸杞子、菟絲子及淫羊藿等組成。已有的研究提示，原方中昆明山海棠有較好的抗炎鎮(zhèn)痛與免疫調(diào)節(jié)作用，枸杞子、菟絲子與昆明山海棠配伍可有效降低其毒性，而淫羊藿與昆明山海棠配伍則可增強免疫調(diào)節(jié)作用，改善骨損傷?？傊?，該方有較好的抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)及保護關(guān)節(jié)軟骨的作用，可減輕滑膜炎癥、修復關(guān)節(jié)軟骨的損傷，毒副作用也相對較低[1-2]。臨床研究顯示，昆仙膠囊用于治療RA 患者效果顯著，能有效緩解關(guān)節(jié)疼痛、晨僵癥狀，改善關(guān)節(jié)功能活動，不僅有較好的療效，安全性也得到驗證[3-6]。

近年來，RA 發(fā)病機制的研究取得了較快進展，有關(guān)昆仙膠囊治療RA 的作用機制有待進一步挖掘研究。網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的理論，對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡分析，選取特定信號節(jié)點（nodes）進行多靶點藥物分子設計的新學科。本研究基于網(wǎng)絡藥理學技術(shù)，依托相應數(shù)據(jù)庫和軟件，構(gòu)建“藥物-成分-關(guān)鍵靶點-信號通路”網(wǎng)絡，科學系統(tǒng)地分析昆仙膠囊對 RA 的作用機制，以期為后續(xù)的實驗研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 昆仙膠囊活性成分的篩選和靶點的預測

本研究通過計算系統(tǒng)生物學實驗室的中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索中藥枸杞子、菟絲子、淫羊藿的活性成分，利用本草組鑒（即HERB 數(shù)據(jù)庫，http://herb.ac.cn/）檢索昆明山海棠的活性成分。再根據(jù)化合物口服生物利用度（OB）與類藥性指數(shù)（DL）篩選活性成分，其中，OB 閾值設為OB≥30%， DL 閾值設為DL≥0.18[7-8]。最終得到81 種有效活性成分，并通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取其對應的靶點。

1.2 RA 相關(guān)靶點的篩選

以rheumatoid arthritis 為關(guān)鍵詞，檢索 Genecards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫及OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫，收集 RA 的相關(guān)靶點。

1.3 構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡

為探明藥物活性成分靶點與疾病靶點之間的關(guān)系，將兩部分靶點通過 Venn 圖制作網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）進行交集得出公共靶點，并導入Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡。Cytoscape 軟件的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡，其中的每個節(jié)點代表基因或分子，而節(jié)點與節(jié)點之間的連接代表這些基因或分子之間存在相互作用，節(jié)點的度值代表網(wǎng)絡中節(jié)點與節(jié)點相連的數(shù)目。

1.4 構(gòu)建靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡

為進一步探究靶點蛋白之間的相互作用，將所得的藥物與疾病的公共靶點上傳至在線STRING10.5軟件(http://string db.org)，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡模型。其參數(shù)修改物種為人（homosapiens），其他參數(shù)保持默認設置，獲取PPI 網(wǎng)絡。

1.5 生物過程與通路分析

利用Cytoscape 軟件中的ClueGo 功能對公共靶點進行GO 富集分析和KEGG 富集分析，其中，GO 富集分析分為細胞組成、生物過程以及分子功能 3 個部分。設定閾值P<0.05，保存富集分析的結(jié)果并將其可視化。

2 結(jié)果

2.1 昆仙膠囊有效活性成分及相關(guān)靶點

使用TCMSP 和HERB 數(shù)據(jù)庫檢索枸杞子、菟絲子、淫羊藿及昆明山海棠的化合物共 384 個：其中枸杞子有188 個化合物，菟絲子有29 個化合物，淫羊藿有130 個化合物，昆明山海棠有37 個化合物。依據(jù)OB≥30%且DL≥0.18 篩選出化合物共131 個：其中，枸杞子有45 個，菟絲子有11 個，淫羊藿有23 個，昆明山海棠有7 個。去除重復后，發(fā)現(xiàn)昆仙膠囊中活性成分81 個，再通過TCMSP 獲取對應的藥物成分靶點913 個，刪除重復后得到228 個。部分活性成分見表1。

表1 昆仙膠囊部分活性成分

2.2 RA 靶點的篩選

通過 Genecards 數(shù)據(jù)庫得到 RA 靶點4 465，通過OMIN 數(shù)據(jù)庫得到RA 相關(guān)靶點41 個。通過交集去除重復靶點，共得到RA 相關(guān)靶點4 494 個。

2.3 化合物-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

利用 Venn 圖制作網(wǎng)站將昆仙膠囊活性成分對應的 228 個靶點與 RA 對應的4 494 個靶點進行交集，獲得162 個共有靶點（圖1）。將 162 個共有靶點導入 Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“化合物-靶點”的網(wǎng)絡圖并進行可視化分析（圖2）。網(wǎng)絡圖包含65 個化合物節(jié)點、162 個靶點節(jié)點（公共靶點）和227 條邊，用綠色表示枸杞子的活性成分，紫色代表淫羊藿的活性成分，紅色表示昆明山海棠的活性成分，黃色代表公共活性成分，橘色代表菟絲子的活性成分，藍色代表靶點。連接活性成分與靶點的邊表示兩者之間具有相互作用。依據(jù)網(wǎng)絡拓撲學性質(zhì)可知，節(jié)點較多的化合物或藥物靶點在整個網(wǎng)絡中可能起到關(guān)鍵的作用，因此本研究篩選節(jié)點度較大的節(jié)點進行分析。

圖1 昆仙膠囊活性成分靶點與RA 疾病靶點的公共靶點

圖2 昆仙膠囊主要成分-靶點網(wǎng)絡

排名前5 位的活性成分分別為槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素，分別能與103 個、44 個、36 個、32 個、31 個靶點蛋白發(fā)生作用。排名前5 位的靶點分別為孕酮受體（PGR）、前列腺素過氧化物合酶2（PTGS2）、前列腺素過氧化物合酶1（PTGS1）、鹽皮質(zhì)激素受體基因（NR3C2）、雄激素受體（AR），分別能與34 個、32 個、19 個、18 個、13 個化合物發(fā)生作用。

2.4 昆仙膠囊靶點PPI 網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析

應用STRING 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(圖3)，此網(wǎng)絡圖中通過162 個公共靶點得出，共有邊84 條，同時得到網(wǎng)絡中關(guān)鍵靶點的頻次。根據(jù)“度值>均值”篩選出關(guān)鍵節(jié)點20 個，包括：IL-6、IKBKB、FOS、EGFR、 EGF、 CXCL8、 CHUK、 CCNB1、 MYC、IL4、 IL1B、 VEGFA、 JUN、 CCND1、 BCL2L1、CDKN1A、CASP8、STAT3、IL10、AKT1。度值排名前5 位的靶點分別是AKT1、IL10、STAT3、CASP8及CDKN1A，可能為昆仙膠囊治療RA 的關(guān)鍵靶點。

圖3 昆仙膠囊靶蛋白PPI 網(wǎng)絡圖

2.5 GO 富集與通路富集分析

GO 生物過程（圖4）主要包括：活性氧代謝過程的調(diào)控、正調(diào)控血管生成、凋亡信號通路的負調(diào)控、細胞對化學應激的反應等；分子功能（圖5）包括：激酶活性的調(diào)節(jié)、肽酶活性的調(diào)節(jié)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、激酶調(diào)節(jié)活性等；細胞組成（圖6）包括：囊腔、宿主細胞內(nèi)部分、突觸前膜固有成分等；KEGG 富集分析（圖7）主要包括：IL-17 信號通路、乙型肝炎、催乳素信號通路、麻疹等，其中，IL-17 信號通路的占比最高，其次為乙型肝炎。

圖4 昆仙膠囊干預類風濕關(guān)節(jié)炎的生物過程(P<0.05)

圖5 昆仙膠囊干預類風濕關(guān)節(jié)炎的分子功能 (P<0.05)

圖6 昆仙膠囊干預類風濕關(guān)節(jié)炎的細胞組成(P<0.05)

圖7 昆仙膠囊干預類風濕關(guān)節(jié)炎的KEGG 富集分析(P<0.05)

3 討論

RA 致殘率較高，是對健康危害較大的風濕病之一。昆仙膠囊由昆明山海棠、枸杞子、菟絲子及淫羊藿等中藥組成，治療RA 療效顯著，但具體作用機制尚不十分明確。本研究借助網(wǎng)絡藥理學方法，獲得昆仙膠囊治療RA 的主要活性分子及相關(guān)的靶點基因，進行GO 功能富集和 KEGG 功能分析，預測其治療RA 可能的物質(zhì)基礎和作用機制，為后續(xù)研究提供思路和依據(jù)。

從“化合物-靶點”的網(wǎng)絡圖可以看出，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素是昆仙膠囊中治療RA 的主要活性成分。槲皮素是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，臨床研究提示，單用槲皮素治療的RA 患者晨僵、疼痛和活動后疼痛明顯減輕，疾病活動評分（DAS）和健康評估問卷（HAQ）得分降低，有良好的治療效果[9]。槲皮素能調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）通路；抑制TNF-α、IL-1β、IL-17 和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的水平；減少炎癥細胞向關(guān)節(jié)部位募集來緩解RA 的炎癥[10]。槲皮素可降低基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP-2）的表達和活性，抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移[11]；促進RA 成纖維樣滑膜細胞（FLS）凋亡和抑制FLS 的遷移和侵襲來減輕 RA[12-13]。此外，調(diào)節(jié)破骨/成骨細胞和Th17/Treg平衡可能是槲皮素的另一種調(diào)節(jié)RA 的機制[14]。木犀草素具有良好的抗炎活性，能明顯降低膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠足跖的炎性腫脹程度，潛在抑制RA NLRP3 炎性小體過表達、降低caspase-1、RANKL、VEGF 和HIF-1α 蛋白表達并增強OPG蛋白表達起到骨關(guān)節(jié)保護作用[15]。山奈酚拮抗bFGF / FGFR3 / RSK2 軸可有效降低膠原誘導性關(guān)節(jié)炎小鼠的臨床和組織學評分。山奈酚發(fā)揮抗關(guān)節(jié)炎作用的主要機制是抑制RA FLS 增殖和遷移以及顯著抑制Th17 分化和破骨細胞生成[16]。β-谷甾醇是植物甾醇的重要組成成分，具有抗炎、調(diào)節(jié)人體甾體激素、抗氧化及抗腫瘤等作用[17]。研究顯示，含有β-谷甾醇的白術(shù)醇提物具有顯著的抗炎作用，可明顯降低佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠血清和組織中的 TNF-α、C-反應蛋白和 IL-2 的含量[18]。研究證實，雷公藤甲素又稱雷公藤內(nèi)酯、雷公藤內(nèi)酯醇，具有較為顯著的抗炎作用，RA 病人用藥后關(guān)節(jié)腫痛明顯減輕，有很好的治療效果。研究提示，雷公藤甲素可通過調(diào)節(jié)細胞因子、酶類、核轉(zhuǎn)錄因子 B 的表達，抑制炎癥因子分泌，抑制血管的生成和誘導細胞的凋亡，保護軟骨和基因調(diào)控等方面發(fā)揮抗 RA 藥理作用[19]。

靶點PPI 網(wǎng)絡圖提示，AKT1、IL-10、STAT3、CASP8 及CDKN1A 等可能是昆仙膠囊治療RA 的關(guān)鍵靶點。現(xiàn)有研究提示，蛋白激酶B1(AKT1) 與RA 滑膜成纖維細胞生成有關(guān)[20]，IL-10 在RA 患者血清中存在異常高表達，IL-10 具有多種免疫功能，可以抑制炎癥和細胞免疫反應，加強與適應性免疫和清除功能相關(guān)的耐受性，抑制由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的促炎因子[21]。STAT3 是一個關(guān)鍵性RA 致病因子，能夠抑制成纖維樣滑膜細胞（FLS）凋亡，促進 T 細胞存活及抗體產(chǎn)生，受促炎因子調(diào)控而失衡的 STAT3 信號可導致慢性滑膜炎的產(chǎn)生，抑制STAT3 的磷酸化對緩解關(guān)節(jié)炎癥狀、促進FLS 凋亡意義重大[22]。Caspase-8 在滑膜抗原呈遞細胞中發(fā)揮功能，通過控制RIPK3 的作用來調(diào)節(jié)對炎癥刺激的反應，這種微妙的平衡維持了關(guān)節(jié)內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[23]。RA 患者滑膜組織和成纖維樣滑膜細胞（HFLS）中CDKN1A 下調(diào)。若CDKN1A 過表達可顯著抑制HFLS 的增殖和侵襲，并下調(diào)腫瘤壞死因子（TNF）-α 和IL-6-的表達，上調(diào)了IL-10 的表達[24]。

通路富集分析結(jié)果表明，昆仙膠囊治療 RA 的作用可能主要與干預IL-17、乙型肝炎及催乳素等信號通路有關(guān)，尤其是IL-17 信號通路占比最大，達到57.89%。IL-17 信號通路是細胞外信號引起細胞核內(nèi)反應的通道之一，ACT1 作為IL-17 信號通路的銜接蛋白，與其關(guān)鍵底物TRAF6 結(jié)合，激活下游NF-κB、JNK 等核內(nèi)基因信號通路，誘導炎性細胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，繼而促進RA 滑膜細胞增殖和活化，參與并加重RA 病情[25]。RA 和牙周炎是影響全世界人群的兩種常見的慢性炎癥性疾病。兩種條件之間的關(guān)聯(lián)一直是許多研究的重點，試圖探索這種關(guān)聯(lián)的潛在機制。催乳激素除了促乳作用外，在免疫和炎癥中具有多種作用。一些數(shù)據(jù)表明，滑膜和牙周組織中的催乳素水平顯著增加，并且這種增加與疾病活動和組織破壞有關(guān)。干預催乳素相關(guān)的通路，可能給RA 的治療帶來新的機遇[26]。

綜上所述，昆仙膠囊可能是通過槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素等主要成分，作用于AKT1、IL-10、STAT3、CASP8 及CDKN1A等多個靶點，調(diào)節(jié)IL-17 信號通路、乙型肝炎及催乳素等信號通路，從而抑制炎癥反應、調(diào)節(jié)免疫功能、促進FLS 凋亡和抑制FLS 遷移和侵襲等以治療 RA。本研究提示，昆仙膠囊治療 RA 呈現(xiàn)出多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用優(yōu)勢，為后續(xù)的實驗研究和臨床應用提供了依據(jù)。

致謝 感謝海軍軍醫(yī)大學中醫(yī)系博士研究生蔡孟成在網(wǎng)絡藥理學方面給予的技術(shù)支持及靶點篩選方面的意見與建議。