孟明華 馬賓 趙坤 王紀明 任偉華

(1濟南市第二婦幼保健院，山東 濟南 271199；濟南市人民醫(yī)院 2麻醉科；3藥劑科)

癲癇是最常見的大腦疾病之一，全世界約有5 000萬人受其影響〔1,2〕。雖然癲癇發(fā)作的確切原因尚不清楚，但大量證據表明，過度釋放谷氨酸參與了癲癇發(fā)作的發(fā)病機制。如腦內應用谷氨酸受體激動劑已被證明可誘發(fā)動物癲癇。右美托咪定具有鎮(zhèn)靜，鎮(zhèn)痛麻醉作用。右美托咪定的神經保護作用已在各種腦損傷模型中被報道〔3〕。然而，右美托咪定的神經保護作用機制尚未完全清楚。紅藻氨酸(KA)是一種類似于興奮毒性谷氨酸的物質，它在嚙齒動物體內的全身性給藥會導致反復發(fā)作和隨后大腦中選擇性神經元群的退化，特別是在海馬的CA3區(qū)域。因此，KA常被用于研究興奮性毒性誘導的神經變性機制，以提出具有潛在神經保護作用的藥理學藥物〔4〕。本研究以KA誘導的癲癇模型為基礎，探討右美托咪定對神經的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 動物：成年雄性SD大鼠，體重200～220 g，所有大鼠飼養(yǎng)房間溫度為(23±2)℃，濕度為50%～60%，并保持12 h的晝夜循環(huán)光照。藥品與試劑：右美托咪定(批號：026M4732V，美國Sigma公司)；KA(美國Abcam公司)；Tunnel染色試劑盒(中國碧云天公司)；尼氏染色試劑盒(中國索萊寶公司)；兔多克隆抗體Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12(美國Abcam公司)。儀器：FM0530化學發(fā)光成像系統(美國 Protein Simple公司)；DM 750 光學顯微鏡(日本Olympus公司)；Thermo VarioskanTMLUX多功能酶標儀(美國的Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2構建KA誘導神經元凋亡的模型及給藥 大鼠隨機分對照組、KA組、K+D組各15只。對照組：大鼠腹腔注射0.9% NaCl；KA組：大鼠腹腔注射KA(15 mg/kg)構建模型；K+D組：在注射KA前30 min腹腔注射右美托咪定(5 μg/kg)，1次/d，給藥3 d。

1.3癲癇發(fā)作評分 實驗動物在注射KA后4 h內進行監(jiān)測，以確定癲癇發(fā)作的嚴重程度。根據Racine量表對大鼠KA模型進行癲癇評分。該量表評分為0～5分，0分為正?，F象，1分為面部和耳部抽搐，2分為單側前肢抽搐，3分為雙側前肢完全抽搐，4分為強制性陣攣發(fā)作，5分為廣泛的強制性陣攣發(fā)作。模型鼠出現4級及以上評分的視為達到癲癇模型的標準。

1.4尼氏染色 實驗動物在第3天后用1%戊巴比妥鈉麻醉，待麻醉成功后，逐層皮膚解剖大鼠暴露心臟后，先用0.9%生理鹽水灌注，再用4%多聚甲醛灌注，灌注成功后，斷頭解剖海馬組織，放于多聚甲醛固定48 h。組織經過沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸透制作石蠟切片。選出完整的海馬組織切片，按尼氏染色試劑盒進行染色，然后脫水、透明，封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5TUNEL染色 為了觀察凋亡細胞，根據TUNNEL染色試劑盒對海馬組織切片進行染色。用新鮮配制的透性處理液(含0.1% Triton X-100的0.1%檸檬酸鈉的緩沖液)處理海馬組織切片，然后在冷磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌，在37℃的潮濕環(huán)境中與TUNEL反應液避光孵育60 min，用PBS洗滌3次，加入封閉液于室溫封閉30 min，PBS洗滌，加入轉化劑37℃孵育10 min，洗滌，加入二氨基聯苯胺(DAB)底物，室溫15 min，蘇木素復染50 s，進行酒精脫水，二甲苯透明，封片，最后使用熒光顯微鏡觀察神經元細胞凋亡情況。

1.6Western印跡 將各組大鼠斷頭處死，解剖出腦組織，在冰上立即分離海馬組織，通過研磨勻漿提取總蛋白，測定蛋白濃度〔二喹啉甲酸(BCA)定量〕。然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，先清洗玻璃板，灌膠和上樣，然后電泳至溴酚藍跑出即可終止電泳，按照濾紙-膠-膜-濾紙夾三明治的方法進行轉膜，若膠上的條帶均轉移到膜上即成功，進行封閉，將膜取出在5%脫脂奶粉的皿中常溫慢搖60 min，然后Caspase-3一抗1∶1 000，Caspase-9一抗1∶1 000，Caspase-12一抗1∶1 000在4℃冰箱孵育過夜，用TBST清洗3次，然后二抗在室溫下孵育1～2 h，用TBST在搖床上清洗兩次，每次10 min，再用TBST洗10 min，最后用BIO-RAD公司凝膠成像系統顯色成像進行定量分析，分析蛋白表達情況。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1大鼠癲癇發(fā)作評分結果 在給予KA后30 min內，動物均表現出持續(xù)3～4 h的癲癇行為。與對照組〔(0.00±0.00)分〕比較，KA組癲癇發(fā)作評分〔(4.51±0.42)分〕明顯升高；與KA組相比，K+D組評分〔(2.44±0.51)分〕降低(P<0.05)。

2.2尼氏染色觀察大鼠海馬神經元 與對照組相比，KA組海馬CA3區(qū)神經元數目顯著減少，細胞排列疏松。K+D組海馬CA3區(qū)神經元數目較KA組增多，且細胞排列較密集，有顯著改善作用，見圖1。

圖1 尼氏染色觀察各組海馬神經元的病理學形態(tài)(×200，框中×400)

2.3TUNEL染色測定神經元細胞凋亡 對照組存在少量凋亡細胞；與對照組相比，KA組顯著增加了海馬CA3區(qū)神經元凋亡數目；與KA組比較，K+D組海馬組織CA3區(qū)神經元凋亡數目顯著減少，因此右美托咪定具有抑制由KA引起的細胞凋亡的作用，見圖2。

圖2 Tunnel染色觀察各組海馬神經元凋亡情況(×200)

2.4各組海馬組織Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的蛋白表達 與對照組相比，KA組海馬神經元Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達顯著升高，而K+D組海馬神經元Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12表達較KA組明顯降低(P<0.05)，見表1，圖3。

表1 各組海馬組織Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達比較

圖3 Western印跡檢測海馬組織Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達

3 討 論

眾所周知，在阿爾茨海默病、帕金森病、癲癇、亨廷頓病等神經退行性疾病中，興奮性應激是急性神經元損傷的促進因素〔5，6〕。以前的報告已經證明，在嚙齒動物中使用類似于谷氨酸興奮毒素的KA會導致癲癇發(fā)作〔7〕。本研究表明右美托咪定對KA引起的癲癇發(fā)作有體內抗驚厥作用。海馬體的CA3區(qū)是kainate受體最豐富的區(qū)域，它們的激活導致海馬體和其他大腦結構中選擇性種群的神經元缺失。此外，大量研究表明，在這種興奮毒性模型中觀察到的神經元損失至少部分涉及凋亡〔8，9〕。本研究結果表明，KA注射可導致海馬CA3區(qū)選擇性神經元細胞凋亡。右美托咪定預處理減少了這種誘導的神經元凋亡，提示右美托咪定除了是一種抗驚厥劑外，還是一種有效的神經保護劑。

研究表明，內質網應激介導的細胞凋亡通路可誘導興奮性毒性模型的凋亡〔10〕。內質網是細胞內鈣儲存的場所之一，興奮性毒性誘導的鈣在內質網應激通路中起重要作用，導致細胞凋亡〔11〕。凋亡信號傳導包括3個階段：信號誘導、Caspase級聯激活和執(zhí)行階段。其中Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12在細胞凋亡中具有重要作用，Caspase-3是多種Caspase亞型中的主要Caspase，它能導致神經元細胞的死亡，是凋亡細胞死亡過程中主要的Caspase執(zhí)行者，其特異性地裂解許多關鍵的細胞蛋白，促進細胞的解體〔12〕，Caspase-9是凋亡小體內固有凋亡的關鍵啟動子，在多種細胞死亡誘導因子的作用下被激活，Caspase-12特異性定位于內質網的胞質部位(外膜)，被認為在應激介導的細胞死亡〔13〕中發(fā)揮作用。細胞凋亡的內在途徑包括線粒體外膜的通透化、死亡誘導信號復合物的形成、DNA片段化和Caspase-3的激活。本研究結果表明，KA誘導的Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12激活的減少與右美托咪定發(fā)揮神經保護作用的機制有關。

綜上，右美托咪定對KA構建的癲癇模型大鼠海馬凋亡具有顯著的神經保護作用，而這種神經保護作用可能是由于通過抑制神經元凋亡起作用，減輕了由KA引起的神經毒性作用。而對于具體抑制凋亡的機制還尚不清楚，未來應進一步研究。