萬(wàn)江花 尤曉光 蘇蘭芳 劉旭東 林娟 鄧丹瓊

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放射科，海南 ?？?570102)

乳腺癌屬女性常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率高，是導(dǎo)致女性癌癥患者死亡的主要原因，其中三陰性乳腺癌占乳腺癌的20%左右，相較于其他類型預(yù)后更差、轉(zhuǎn)移率更高，目前治療以化療或輔助化療為主〔1，2〕。化療后患者化療敏感性降低，可能出現(xiàn)預(yù)后較差、復(fù)發(fā)等嚴(yán)重現(xiàn)象，化療后中位生存時(shí)間約1年〔3〕，因此尋找新輔助化療方法從而提高化療敏感性對(duì)于疾病治療意義重大。微小RNA(miRNA)在改善化療敏感性中逐漸被發(fā)現(xiàn)，miRNA通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)源性或外源性凋亡通路蛋白從而影響化療敏感性〔4〕，其中miR-369-3p在大腸癌中靶向雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶(DYRK)1A可調(diào)節(jié)放療敏感性，而DYRK1A影響細(xì)胞凋亡〔5〕。但乳腺癌中并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究以三陰性乳腺癌MDA-MB-231為研究對(duì)象，檢測(cè)miR-369-3p對(duì)細(xì)胞放療敏感性的影響，為輔助乳腺癌化療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 人乳腺癌MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)：TCHu227。

1.2主要試劑與儀器 L-15培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)GIBIO公司，貨號(hào)分別為：41300039、10099-141；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Ambion公司，貨號(hào)：AM1552)；熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，貨號(hào)：ARR041A)；CCK-8試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)分別為：C0039、C1062M)；一抗DYRK1A(兔抗)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3(兔抗)、caspase9(兔抗)、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH，兔抗)、羊抗人二抗(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為：ab65220、ab181602、ab32539、ab32539、ab97051)；引物由上海生工生物公司合成；miR-369-3p mimic、miR-369-3p mimic NC、miR-369-3p inhibitor、miR-369-3p inhibitor NC、Lipofectamine 2000均購(gòu)自上海吉瑪公司。

CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)WIGGENS公司，型號(hào)：WCI-180)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)：7500)；Varian 2100直線加速器(美國(guó)Ohio公司，型號(hào)：Clinac-2100C/D)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)：550)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Thermo Fisher公司，型號(hào)：Attune NxT)；蛋白凝膠成像儀(上海天能科技有限公司，型號(hào)：5200)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和處理 細(xì)胞培養(yǎng)：L-15培養(yǎng)基中加10%FBS制成L-15完全培養(yǎng)基，4℃冰箱保存待用。MDA-MB-231，75%酒精消毒培養(yǎng)瓶后立即置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，第2天分離出部分細(xì)胞置于L-15完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)待用，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)保種。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞傳2～3代后收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。

細(xì)胞處理：生長(zhǎng)良好的MDA-MB-231稀釋成1×105個(gè)/ml，24孔板中添加500 μl稀釋液，待細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)，吸出舊培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)染。1 μl Lipofectamine 2000與50 μl L-15培養(yǎng)基混勻，室溫孵育5 min；2 μl(miR-369-3p mimic、miR-369-3p mimic NC、miR-369-3p inhibitor、miR-369-3p inhibitor NC)分別與50 μl L-15培養(yǎng)基混勻，室溫孵育5 min。上述兩混合液1∶1混勻后，室溫放置15 min。miR-369-3p mimic組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor組、miR-369-3p inhibitor NC組分別添加500 μl對(duì)應(yīng)混合液，對(duì)照組只添加MDA-MB-231細(xì)胞換新的L-15培養(yǎng)基對(duì)照處理。輕輕搖板混勻，37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，換成L-15完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-369-3p水平1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度90%左右時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞中miR-369-3p的表達(dá)水平。每個(gè)孔中加1 ml Trizol裂解細(xì)胞，部分并提總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA，qRT-PCR儀對(duì)miR-369-3p、內(nèi)參U6擴(kuò)增。引物序列 miR-369-3p正義鏈：5′-TGGGAATAATACATGGTTGATC-3′、反義鏈：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6正義鏈：5′-TGCTGGGGCTTTCCGGCAGCGC-3′、反義鏈：5′-CCCAGTGAGGTCCGGAGGT-3′。上樣體系20 μl：2×熒光定量PCR試劑(10 μl)、cDNA(1 μl)，正義鏈/反義鏈(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O(8 μl)。反應(yīng)條件：95℃、5 min；95℃、60 s，62℃、45 s，45個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中miR-369-3p水平。

1.4.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞接種至96孔板(5.0×104個(gè)/孔)，L-15完全培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每孔100 μl，6個(gè)重復(fù)。Varian 2100直線加速器6 MV X線為放射源(劑量率400 cGy/min、照射野100 mm×100 mm)照射MDA-MB-231，劑量用計(jì)算機(jī)治療系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整，包括2、4、6、8 Gy 4個(gè)計(jì)量點(diǎn)繪制劑量存活曲線，每個(gè)計(jì)量點(diǎn)照射完成時(shí)間1～2 min。照射完成后置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下各孔細(xì)胞光密度(OD)，OD450=實(shí)驗(yàn)孔OD450-空白對(duì)照孔OD450。存活率=〔OD450-0 Gy-OD450-(2、4、6、8)Gy〕/OD450-0 Gy×100%。

1.4.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 0、6 Gy照射檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，1.4.1各組細(xì)胞每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞過(guò)夜后貼壁，按1.4.2操作6 Gy照射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化處理各組細(xì)胞，各組細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)，加入Annexin V-FITC和PI試劑，混勻避光15 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.4.4Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中DYRK1A、caspase3、caspase9蛋白表達(dá)情況 0、6 Gy照射檢測(cè)細(xì)胞中DYRK1A蛋白的表達(dá)情況，按1.4.2操作6 Gy照射細(xì)胞，裂解細(xì)胞，部分3 000 r/min 4℃離心20 min，取上清檢測(cè)DYRK1A蛋白水平。BCA試劑盒測(cè)定每個(gè)樣本中蛋白總濃度，補(bǔ)ddH2O使每孔總蛋白濃度相同。每孔上樣30 ng，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質(zhì)，280 mA轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對(duì)應(yīng)加入一抗DYRK1A(1∶1 000)、caspase3(1∶2 000)、caspase9(1∶5 000)、GADPH(1∶5 000)，4℃孵育過(guò)夜；對(duì)應(yīng)加入二抗，室溫孵育1 h。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。Targetscan預(yù)測(cè)DYRK1A基因與miR-369-3p結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞中miR-369-3p水平比較 分別與對(duì)照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，miR-369-3p mimic組細(xì)胞中miR-369-3p水平顯著升高(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組細(xì)胞中miR-369-3p水平顯著降低(P<0.05)。與miR-369-3p mimic組相比，miR-369-3p inhibitor組細(xì)胞中miR-369-3p水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組miR-369-3p水平、細(xì)胞凋亡率及DYRK1A蛋白表達(dá)比較

2.2miR-369-3p對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞放療敏感性的影響 分別與對(duì)照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，0、2、4、6、8 Gy中miR-369-3p mimic組存活率均顯著降低(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組存活率均顯著升高(P<0.05)。隨著X線照射劑量升高，對(duì)照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p mimic組、miR-369-3p inhibitor組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miR-369-3p對(duì)MDA-MB-231不同劑量X線照射的存活率

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果 在0、6 Gy中，分別與對(duì)照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，miR-369-3p mimic組凋亡率顯著升高(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組凋亡率顯著降低(P<0.05)。與0 Gy相比，6 Gy照射下對(duì)照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p mimic組、miR-369-3p inhibitor組均凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

1～5：對(duì)照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p mimic組、miR-369-3p inhibitor組；圖2、3同

2.4各細(xì)胞中DYRK1A蛋白表達(dá)的比較 在0、6 Gy中，分別與對(duì)照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，miR-369-3p mimic組DYRK1A蛋白水平顯著降低(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組DYRK1A蛋白水平顯著升高(P<0.05)。與0 Gy相比，6 Gy照射下對(duì)照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p mimic組、miR-369-3p inhibitor組DYRK1A蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中DYRK1A蛋白表達(dá)情況

2.5各組細(xì)胞中caspase3、caspase9蛋白表達(dá)比較 在0、6 Gy中，分別與對(duì)照組、miR-369-3p mimicNC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，miR-369-3p mimic組caspase3、caspase9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組caspase3、caspase9蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與0 Gy相比，6 Gy照射下對(duì)照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p inhibitor組caspase3、caspase9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，miR-369-3p mimic組caspase9蛋白水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中caspase3、caspase9蛋白表達(dá)

表3 各組caspase3、caspase9蛋白表達(dá)

2.6miR-369-3p靶向DYRK1A基因 Targetscan(http：//www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，DYRK1A基因與miR-369-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。

圖4 DYRK1A基因與miR-369-3p結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)〔4〕

3 討 論

乳腺癌目前治療方法以化療為主，仍有30%～40%患者出現(xiàn)化療抗性〔6〕。提高患者化療敏感性對(duì)于改善患者生存質(zhì)量意義重大。其中細(xì)胞凋亡在化療敏感性中發(fā)揮重要作用，癌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，化療敏感性明顯增強(qiáng)，可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡改善化療敏感性，從而治療腫瘤〔7〕。

miRNA在癌細(xì)胞凋亡〔8〕和放射抵抗〔9〕中起重要作用。miR-205-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中低劑量電離輻射潛在的放射增敏劑，增強(qiáng)化療敏感性可增強(qiáng)對(duì)毒性細(xì)胞的殺傷作用，降低對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，減少正常細(xì)胞DNA的損傷，從而達(dá)到治療疾病目的〔10〕；放射抗性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織miR-320表達(dá)下調(diào)，而叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(Fox)M1表達(dá)上調(diào)，miR-320過(guò)表達(dá)直接靶向FoxM1下調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子(sirtuin)1型蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的放射敏感性〔11〕。miR-369-3p是miR-369的成熟剪輯體之一，是一種功能多樣的miRNA，可通過(guò)自噬調(diào)節(jié)參與子宮內(nèi)膜樣腺癌〔12〕；亦是一種與放療敏感性有關(guān)的基因〔13〕。miR-369-3p在順鉑耐藥的非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)miR-369-3p可提高肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性〔14〕；可調(diào)控miRNA的表達(dá)來(lái)影響相關(guān)信號(hào)通路可調(diào)節(jié)乳腺癌的化療敏感性〔15〕。本研究結(jié)果提示X線照射可抑制乳腺癌細(xì)胞存活，隨著X線照射劑量強(qiáng)度的增加，抑制作用加強(qiáng)，X線照射對(duì)治療疾病具有一定療效，X線照射水平越高，治療效果越明顯。但隨著X線照射的增加，對(duì)正常細(xì)胞殺傷作用加強(qiáng)，同時(shí)機(jī)體出現(xiàn)放射抵抗〔16〕，發(fā)現(xiàn)在較低劑量X線照射對(duì)癌細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷作用是接下來(lái)探索重點(diǎn)。升高miR-369-3p水平存活率降低，降低miR-369-3p水平存活率升高；miR-369-3p可在一定程度上影響MDA-MB-231存活率，升高miR-369-3p可抑制細(xì)胞增殖提高化療敏感性，緩解疾病。相同劑量X線照射，升高miR-369-3p水平可提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞化療敏感性，從而增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)降低對(duì)正常細(xì)胞的損害達(dá)到治療疾病目的。

miRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合靶基因調(diào)控基因發(fā)揮增殖〔17〕、侵襲〔18〕、凋亡〔19〕、化療敏感性〔20〕等作用。其中DYRK1A作為一種脯氨酸/精氨酸指導(dǎo)下的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化蛋白激酶，可以介導(dǎo)哺乳動(dòng)物Fox1的表達(dá)，而Fox1可以調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡，從而增加細(xì)胞化療敏感性〔21〕。另一方面DYRK1A可以直接影響細(xì)胞凋亡，例如在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)可促進(jìn)DNA損傷介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等引起神經(jīng)元病變、死亡等病理變化，起致病作用〔22〕；在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，抑制DYRK1A水平可有效治療表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)敏感性突變和耐藥基因(T790 M)耐藥性突變的非小細(xì)胞肺癌患者的敏感性從而實(shí)現(xiàn)抗癌作用〔23〕。DYRK1A抑制劑可抑制MDA-MB-231增殖從而緩解乳腺癌〔24〕。miR-369-3p與DYRK1A靶向結(jié)合，升高miR-369-3p水平降低DYRK1A水平可能緩解乳腺癌〔5〕。本研究提示化療后可降低DYRK1A蛋白水平，對(duì)細(xì)胞的殺傷作用加強(qiáng)；低表達(dá)DYRK1A蛋白可能促進(jìn)Fox1的表達(dá)，調(diào)控DNA的損傷作用加強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而增加細(xì)胞化療敏感性，從而達(dá)到治療疾病目的。

caspase3、caspase9作為促凋亡蛋白，在MDA-MB-231中促進(jìn)凋亡蛋白caspase3、caspase9水平可抑制細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞毒性從而實(shí)現(xiàn)抗癌作用〔25,26〕。細(xì)胞凋亡在化療敏感性中發(fā)揮重要作用，癌細(xì)胞凋亡率可以判定腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性〔27〕，在宮頸癌耐藥細(xì)胞中促進(jìn)caspase3、caspase9水平可提高細(xì)胞的化療敏感性〔28〕。本研究提示相同劑量X線照射，提高miR-369-3p水平可直接作用DYRK1A，抑制DYRK1A蛋白表達(dá)從而加強(qiáng)促凋亡蛋白表達(dá)、加速癌細(xì)胞DNA損傷，從而加速細(xì)胞凋亡，提高化療敏感性。

綜上所述，miR-369-3p通過(guò)靶向調(diào)控DYRK1A可改變?nèi)橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞放療敏感性，可能是通過(guò)凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。上調(diào)miR-369-3p表達(dá)可靶向抑制DYRK1A表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞對(duì)X線敏感性。本研究只初步探討miR-369-3p變化對(duì)凋亡蛋白水平的影響，并沒(méi)有進(jìn)一步驗(yàn)證DYRK1A與促凋亡蛋白的關(guān)系，接下來(lái)研究中將探討二者之間直接關(guān)系。