楊丹 王軍 李開言

(河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)為裱襯于整個心血管系統(tǒng)內(nèi)表面的單層扁平鱗狀細(xì)胞，是形成心血管封閉系統(tǒng)的形態(tài)基礎(chǔ)和血管通透性的主要屏障〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)凋亡能夠造成內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能受損，是血管內(nèi)皮損傷的主要途徑。細(xì)胞凋亡主要有胞外和胞內(nèi)兩種途徑〔2〕，胞外途徑即死亡受體介導(dǎo)途徑；胞內(nèi)途徑包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑細(xì)胞凋亡〔3〕。目前研究提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧化自由基升高等均可通過刺激僅含BH3區(qū)域蛋白(BH3-only)蛋白或其他途徑的蛋白將信號傳導(dǎo)至線粒體激活胞內(nèi)途徑細(xì)胞凋亡。研究表明B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2調(diào)控基因家族可影響細(xì)胞凋亡過程的進(jìn)行，相關(guān)活性物質(zhì)的刺激造成的線粒體破壞，進(jìn)一步激活程序化死亡蛋白，最終通過活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)或以不依賴Caspases的方式導(dǎo)致細(xì)胞程序化死亡〔4,5〕。野薔薇根系薔薇科Rosaceae薔薇屬Rosa植物多花薔薇的干燥根皮，苦、澀、寒、無毒。野薔薇中富含黃酮類成分，其中根皮中含量最高(137.2 mg/g)〔6〕。前期臨床研究表明野薔薇根制劑能降低高脂血癥患者血液中膽固醇、三酰甘油及β-脂蛋白含量，具有明顯的降脂作用；動物實驗發(fā)現(xiàn)野薔薇根能降低實驗性高脂血癥大鼠膽固醇含量，減輕大鼠心肌缺血程度，預(yù)防和治療大鼠實驗性動脈粥樣硬化〔7,8〕；細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)野薔薇根總黃酮(TF-RM)對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)損傷的HUVEC有保護(hù)作用〔9〕。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過檢測細(xì)胞存活率、凋亡率及凋亡蛋白表達(dá)，研究TF-RM對血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究TF-RM治療動脈粥樣硬化(AS)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動物及細(xì)胞株 SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證編號：SCXK(魯)20180007，動物編號：37009200005670。HUVEC細(xì)胞株，江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司。

1.2藥物 野薔薇根，安徽亳州藥材市場，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院中藥所馬開副研究員鑒定為薔薇科植物野薔薇的干燥根。按照本課題組前期研究方法〔10〕提取純化野薔薇根總黃酮，所得TF-RM含量為54.209%。辛伐他汀片，浙江京新藥業(yè)股份有限公司(國藥準(zhǔn)字H20000009，批號A1807203)。

1.3儀器及試劑 ELX800全功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；HF160W CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；CKX53倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；2K15冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；IMS-40制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶消化液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：13D17B21、T5016、20171228)；澳洲新生胎牛血清(FBS，江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司，批號：S171204F)；氧化低密度脂蛋白(廣州奕源生物技術(shù)有限公司，批號：20190418)；雙色蛋白上樣緩沖液4X(武漢博士德生物工程有限公司，批號：13C27C98)；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、β-actin兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：50599-2-1g、12789-1-AP、19677-1-AP、10380-1-AP、60008-1-1g、SA00001-2)。

1.4分組、給藥及含藥血清制備 SPF級SD雄性大鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只：空白組(去離子水)、辛伐他汀組(1.8 mg/kg)〔11〕、TF-RM組(2.5 g/kg)，灌胃給藥，給藥體積為10 ml/kg，每天1次，連續(xù)7 d。第7天給藥后1 h，麻醉大鼠，腹主動脈取血，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌、分裝后，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5HUVEC培養(yǎng)和分組 HUVEC細(xì)胞株，用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度80%左右時進(jìn)行實驗。實驗分組：空白組(體積分?jǐn)?shù)為15%的空白血清)，模型組(15%的空白血清+ox-LDL 160 μmol/L)，辛伐他汀組(15%辛伐他汀血清+ox-LDL 160 μmol/L)，TF-RM低劑量組(5%TF-RM血清+10%空白血清+ ox-LDL 160 μmol/L)、中劑量組(10%TF-RM血清+5%空白血清+ox-LDL 160 μmol/L)、高劑量組(15%TF-RM血清+ox-LDL 160 μmol/L)。

1.6不同濃度ox-LDL對HUVEC活力的影響 HUVEC細(xì)胞株，用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度80%左右時，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗一遍，分別加入ox-LDL濃度為0、120、140、160、180、200 μmol/L+15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基×5孔，每孔150 μl，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入0.5% MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h后吸棄舊的培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，室溫避光振蕩10 min。570 nm波長下檢測各孔OD值，計算細(xì)胞存活率。

1.7HUVEC存活率檢測 HUVEC細(xì)胞株，用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，吸棄上清液，實驗分組同1.5，每組5個復(fù)孔，每孔150 μl，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入0.5%MTT溶液20 μl，置培養(yǎng)箱中放置4 h，吸棄舊的培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl，室溫避光振蕩10 min，570 nm波長下檢測各孔OD值。

1.8HUVEC凋亡率檢測 HUVEC以1×105個/ml接種于6孔板，每孔2 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。吸棄上清液，實驗分組同1.5，每孔2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)14 h。用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化貼壁細(xì)胞，輕柔吹打成懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)基中和并收集細(xì)胞，500～1 000 r/min離心5 min，棄去舊的培養(yǎng)基。3 ml預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞1次，500～1 000 r/min離心4 min，結(jié)合緩沖液(1×)2 ml洗細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞重懸于95 μl結(jié)合緩沖液(1×)中，加入5 μl 膜聯(lián)蛋白(Annexin)V使細(xì)胞混懸液終體積為100 μl，避光、室溫孵育10～15 min。結(jié)合緩沖液(1×)2 ml洗細(xì)胞，離心后重懸細(xì)胞于200 μl結(jié)合緩沖液(1×)。上機(jī)前5 min加入5 μl碘化丙啶(PI)染料，再加400 μl結(jié)合緩沖液(1×)，過300目篩，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.9HUVEC中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)檢測 組裝玻璃板，加入分離膠5 ml，分離膠凝固后加入濃縮膠并插入梳子，待濃縮膠聚合完成后裝進(jìn)電泳槽，倒好電泳液拔梳子。按預(yù)定的順序加入樣品，電壓設(shè)80 V，當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，電壓設(shè)120 V，直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部。將膠、濾紙和聚偏氟乙烯(PVDF)膜平衡10 min后制作三明治并接通電源，4℃，150 mA轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜放入封閉液中，4℃條件下孵育過夜。一抗37℃孵育2 h，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TBST)洗膜5 min×6次，二抗37℃孵育30～60 min，洗膜5 min×6次，曝光并分析條帶。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗、Games-Howell檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度ox-LDL對HUVEC活力的影響 隨著ox-LDL濃度升高，HUVEC活性逐漸降低。與0 μmol/L組比較，ox-LDL濃度在160 μmol/L時，HUVEC存活率為50%左右，因此選用160 μmol/L作為最佳損傷模型的ox-LDL濃度。見表1。

表1 不同濃度ox-LDL對HUVEC活力的影響

2.2TF-RM對ox-LDL損傷HUVEC存活率的影響 與空白組比較，模型組HUVEC存活率顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，TF-RM低、中、高劑量組能顯著提高HUVEC存活率(P<0.05,P<0.01)。見表2。

2.3TF-RM對ox-LDL損傷HUVEC凋亡率的影響 與空白組比較，模型組正常細(xì)胞比率顯著減少(P<0.01)，早期凋亡率顯著增加(P<0.01)，晚期細(xì)胞凋亡率及壞死率有增高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，TF-RM高劑量組正常細(xì)胞比率顯著增加(P<0.05)，早期細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，晚期細(xì)胞凋亡率及壞死率有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。TF-RM低、中劑量組正常細(xì)胞比率增加，早晚期細(xì)胞凋亡率、壞死率下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 TF-RM含藥血清對ox-LDL損傷HUVEC存活率和凋亡率的影響

B1.壞死細(xì)胞；B2.晚期凋亡細(xì)胞；B3.正常細(xì)胞；B4.早期凋亡細(xì)胞

2.4TF-RM對ox-LDL損傷HUVEC中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)影響 與空白組比較，模型組HUVEC中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01,P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bax表達(dá)有增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，TF-RM低、中、高劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，TF-RM中、高劑量組Bcl-2含量顯著增加(P<0.05)，TM-RM低、中、高劑量組Bax、Caspase-9蛋白表達(dá)有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3、圖2。

表3 TF-RM含藥血清對ox-LDL損傷HUVEC中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的影響

圖2 TF-RM含藥血清對ox-LDL損傷HUVEC中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

隨著對VEC生物功能的不斷認(rèn)識探究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能損傷是AS的始動環(huán)節(jié)。ox-LDL損傷內(nèi)皮細(xì)胞，增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附，誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。ox-LDL還能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，促進(jìn) AS形成及發(fā)展〔12〕。檢測細(xì)胞凋亡率比較經(jīng)典的是流式細(xì)胞術(shù)，Annexin V和PI染色法可檢測出細(xì)胞不同時期的凋亡率，Annexin V可與早期凋亡的細(xì)胞膜相結(jié)合，通過異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記。PI可透過凋亡中、晚期細(xì)胞和死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜將細(xì)胞核染紅，但不能通過完整的細(xì)胞膜，PI與Annexin V合用，可區(qū)分不同時期的細(xì)胞凋亡〔13〕。細(xì)胞凋亡是多種凋亡因素共同起作用的復(fù)雜過程。其中Bcl-2調(diào)控基因家族的Bcl-2和Bax及Caspase調(diào)控基因家族的Caspase-3和Caspase-9對細(xì)胞凋亡影響顯著。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2可通過阻止促凋亡基因信號傳遞或抑制誘導(dǎo)基因產(chǎn)物如細(xì)胞色素C的釋放等發(fā)揮作用，同時其具有抗氧化劑作用通過抑制自由基而發(fā)揮抗凋亡作用。Bax則具有促進(jìn)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2族基因產(chǎn)物能激活Caspases，引發(fā)下游酶聯(lián)反應(yīng)，Caspases成員是細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵環(huán)節(jié)和最主要執(zhí)行者。Caspase-8、Caspase-9為起始凋亡蛋白酶，在細(xì)胞凋亡因素刺激下活化并激活下游底物；Caspase-3為效應(yīng)凋亡蛋白，受到凋亡蛋白酶激活后，導(dǎo)致DNA損傷與細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，最終引起細(xì)胞死亡〔14〕。

近年來ox-LDL通過作用于內(nèi)皮細(xì)胞影響AS的發(fā)生發(fā)展等方面的研究越來越受到重視，為尋求更多的治療方法，中藥在預(yù)防治療心血管疾病中的作用越來越明顯。野薔薇在我國廣泛種植，喜生于路旁、田邊或丘陵地的灌木叢中，來源廣泛。1974年初，河南省中醫(yī)藥研究院對野薔薇根進(jìn)行了原產(chǎn)地調(diào)查、生藥學(xué)、化學(xué)成分分析、藥理活性篩選及新藥開發(fā)等系統(tǒng)研究。1976年初步發(fā)現(xiàn)野薔薇根制劑具有明顯的降脂作用。1978 ～1982年，與河南醫(yī)學(xué)院、460醫(yī)院、光山縣人民醫(yī)院、安陽市人民醫(yī)院協(xié)作，進(jìn)行野薔薇根制劑降脂作用的臨床觀察，1980年改名為降脂靈，369例高脂血癥患者臨床試驗結(jié)果表明：降脂靈為廣譜降脂藥，降膽固醇的有效率為85.90%，降三酰甘油有效率為78.88%，降β-脂蛋白的有效率為69.90%〔7〕。2016年通過高脂飲食聯(lián)合注射維生素D3并加免疫損傷復(fù)制AS大鼠模型，灌胃給予野薔薇根醇提物90 d，發(fā)現(xiàn)野薔薇根醇提物對大鼠實驗性AS具有預(yù)防和治療作用〔8〕。本實驗研究結(jié)果表明TF-RM含藥血清能明顯增加ox-LDL誘導(dǎo)損傷HUVEC的存活率，明顯減少HUVEC早、晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量，降低細(xì)胞壞死率，其機(jī)制與提高抑細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)、降低促細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)有關(guān)。開展對野薔薇的深入研究，尤其是野薔薇根黃酮類成分在心腦血管方面的應(yīng)用，有望將野薔薇開發(fā)成為治療心腦血管疾病的藥物，為臨床提供更多的治療手段，同時也對擴(kuò)大心血管疾病藥源有可觀的價值。