艾民 桑林 王自立 張洪俠 劉寶新

(1長春大學(xué)特殊教育學(xué)院中醫(yī)系，吉林 長春 130022；吉林大學(xué) 2中日聯(lián)誼醫(yī)院體檢中心；3校醫(yī)院康復(fù)科)

腎細(xì)胞癌(RCC)占腎癌病例的90%以上，是全世界最致命的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一〔1〕。盡管近年來腎細(xì)胞癌的治療取得了進(jìn)展，但由于腎癌轉(zhuǎn)移和耐藥性，腎細(xì)胞癌患者的總體生存率仍然不令人滿意〔2〕。順鉑(CDDP)是一種鉑類抗癌藥物，已廣泛用于各種癌癥類型，包括RCC〔3〕；然而，其嚴(yán)重的副作用和產(chǎn)生的耐藥性往往限制了其在RCC中的臨床應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，微小RNA(miRNAs)細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、代謝等多種過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用〔4，5〕。眾所周知，miRNAs可以通過不完全結(jié)合靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而導(dǎo)致翻譯抑制和(或)靶基因降解〔6〕。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs參與RCC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并作為腫瘤抑制因子或癌基因發(fā)揮作用〔7，8〕。通過miRNAs介導(dǎo)的影響腫瘤化療的耐藥性已成為大量研究的熱點(diǎn)〔9，10〕。

miR-137是一種典型的23-nt miRNA，最初在2002年被鑒定為卵巢癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌中的腫瘤抑制性miRNA〔11～16〕。miR-137在RCC組織中表達(dá)下調(diào)，并在RCC進(jìn)展中發(fā)揮腫瘤抑制作用〔17〕。此外，一些研究表明，miR-137可能參與調(diào)節(jié)多種癌癥對(duì)多種抗癌藥物的耐藥性〔18～21〕。然而尚不清楚miR-137在RCC細(xì)胞化療敏感性中的作用，本研究詳細(xì)研究了miR-137對(duì)人RCC細(xì)胞CDDP敏感性的影響情況。

1 材料和方法

1.1材料 兩種人類RCC細(xì)胞系(A498，一種腎癌上皮樣細(xì)胞；和786-O，人腎透明細(xì)胞腺癌)購自美國ATCC細(xì)胞培養(yǎng)庫；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、LPS 購自 Sigma-Aldrich 公司；TRIzol、Lipofectamine2000試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；miScript RT試劑盒、miScript SYBR Green PCR購自德國 Qiagen公司；雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于美國BD 公司；miR-137模擬物和相應(yīng)的陰性對(duì)照miRNA(miR-NC)購自上?；蛑扑幱邢薰?；CDDP 購買于Sigma-Aldrich，溶解在0.9%的無菌鹽水中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8購自Dojindo Molecular Technologies，Inc.公司。半胱天冬酶3活性測(cè)定試劑盒購自Beyotime Institute of Biotechnology公司，流式細(xì)胞儀購自美國 BD 公司，實(shí)時(shí)熒光PCR儀購自美國 ABI公司；酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)購自Sigma-Aldrich公司。

1.2耐藥細(xì)胞系的建立 為了建立抗CDDP的RCC細(xì)胞(RCC/CDDP)，采用逐漸增加劑量的CDDP處理786-O和A498細(xì)胞，直到存活的細(xì)胞顯示出正常的生長模式。786-O和A498細(xì)胞首先用0.5 μg/ml的CDDP處理4 h，然后釋放到無CDDP的 RPMI1640培養(yǎng)基中，直到恢復(fù)。對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行相同的處理，CDDP濃度逐漸增加，最后增加到5 μg/ml。當(dāng)誘導(dǎo)細(xì)胞仍在5 μg/ml的CDDP中存活時(shí)，證實(shí)細(xì)胞對(duì)CDDP具有耐藥性，并將這兩種耐CDDP的RCC細(xì)胞分別命名為786-O/CDDP和A498/CDDP。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)使用說明，使用脂質(zhì)體2000將miR-137模擬物和對(duì)照miR-NC模擬物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到RCC細(xì)胞或者RCC/CDDP細(xì)胞中(786-O/CDDP和A498/CDDP)。

1.4RNA分離和RT-qPCR 參照TRIzol使用說明，利用TRIzol試劑從培養(yǎng)的RCC細(xì)胞和RCC/CDDP細(xì)胞中提取總RNA。 miScript RT 試劑盒 用于從1 μg總RNA合成cDNA。使用miScript SYBR Green PCR試劑盒在ABI PRISM 7900熒光定量PCR儀上對(duì)miR-137的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件如下：95℃，2 min，95℃，35 s 40個(gè)循環(huán)，56℃，40 s。引物序列如下：miR-137正向引物為5′-GCGCTTTTGCTTAGATAC-3′，反向5′-CAGTGCAGGGTCAGGT-3′；U6正向引物為5′-GCTTCGGCAGCATATATAT ATATAAAT-3′，反向5′-CGCTTCACGAATTGCGTCAT-3′；miR-137的相對(duì)表達(dá)量分析使用2-ΔΔCt方法計(jì)算〔22〕，以U6 snRNA作為內(nèi)部對(duì)照。

1.5細(xì)胞增殖試驗(yàn) 使用CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在96孔板(2×103細(xì)胞/孔)中放置24、48、72、96或120 h。隨后，將CCK-8溶液添加到這些孔中在培養(yǎng)2 h。使用分光光度計(jì)測(cè)量溶液450 nm處的吸光度。

1.6凋亡檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后48 h后，使用0.25%胰蛋白酶分離細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)加入異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒。避光15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。使用CellQuest軟件(版本0.9.3.1)分析凋亡數(shù)據(jù)。

1.7半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-3活性測(cè)定 轉(zhuǎn)染48 h后收獲RCC細(xì)胞。使用Caspase-3活性測(cè)定試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnology)測(cè)定Caspase-3活性。

1.8統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS27.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，Tukey事后檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1RCC抗CDDP細(xì)胞株(A498/CDDP和786-O/CDDP)細(xì)胞增殖增加 與RCC細(xì)胞(A498和786-O)相比，RCC/CDDP細(xì)胞(A498/CDDP和786-O/CDDP)48、72、96、120 h的細(xì)胞增殖顯著增加(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 CCK8法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)不同細(xì)胞株RCC細(xì)胞和RCC/CDDP細(xì)胞的增殖情況

2.2miR-137在RCC細(xì)胞中及RCC抗CDDP細(xì)胞中的表達(dá) 與正常RCC細(xì)胞(786-O：1.0±0.12、A498：1.0±0.14)相比，RCC/CDDP細(xì)胞株中miR-137的表達(dá)水平顯著降低(0.42±0.06、0.38±0.05，P<0.05,P<0.01)。

2.3轉(zhuǎn)染 miR-137模擬物增加了miR-137在A498/CDDP和786-O/CDDP細(xì)胞中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-137模擬物顯著增加miR-137在A498/CDDP和786-O/CDDP細(xì)胞中表達(dá)(P<0.01)。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-137模擬物或miR-NC的786-O/CDDP和A498/CDDP細(xì)胞中miR-137的表達(dá)

2.4過表達(dá)miR-137降低 A498/CDDP和786-O/CDDP細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染miR-137模擬物48、72、96、120 h后可顯著降低A498/CDDP和786-O/CDDP細(xì)胞的增殖(P<0.05,P<0.01)，見表3。

表3 轉(zhuǎn)染miR-137對(duì)786-O/CDDP和A498/CDDP細(xì)胞增殖的影響

2.5過表達(dá)miR-137增加 A498/CDDP和786-O/CDDP細(xì)胞凋亡 過表達(dá)miR-137顯著誘導(dǎo)A498/CDDP和786-O/CDDP細(xì)胞凋亡(P<0.05,P<0.01)，見表4。

表4 轉(zhuǎn)染 miR-137對(duì)786-O/CDDP和A498/CDDP細(xì)胞凋亡的影響

2.6過表達(dá)miR-137增加 A498/CDDP和786-O/CDDP細(xì)胞Caspase-3活性 與轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞相比，miR-137過表達(dá)顯著增加了A498/CDDP和786-O/CDDP細(xì)胞中的Caspase-3活性(P<0.01),見表5。

表5 轉(zhuǎn)染 miR-137對(duì)786-O/CDDP和A498/CDDP細(xì)胞中caspase-3表達(dá)的影響

3 討 論

先前的研究表明miRNAs通過調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因來調(diào)節(jié)RCC化療耐藥性〔9，10〕。如miR-31-5p過表達(dá)通過靶向RCC中的mutL同源物1促進(jìn)索拉非尼耐藥性〔23〕。Sekino等發(fā)現(xiàn)，miR-130b通過調(diào)節(jié)染色體10上刪除的磷酸和張力同源性，增加了RCC細(xì)胞對(duì)舒尼替尼的耐藥性〔24〕。Li等〔25〕表明，miR-210-3p通過靶向ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型C1降低RCC的化療耐藥性。

miR-137已經(jīng)被報(bào)道參與調(diào)節(jié)幾種癌癥的藥物敏感性〔24〕。例如，miR-137增強(qiáng)了非小細(xì)胞肺癌對(duì)紫杉醇和CDPP的化療敏感性〔21〕，降低了前列腺癌細(xì)胞對(duì)比卡魯胺的耐藥性〔18〕，對(duì)化療藥物奧沙利鉑的化療敏感性結(jié)腸癌細(xì)胞〔20〕，并調(diào)節(jié)了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性〔26〕。然而，miR-137在RCC化療敏感性中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明miR-137可以增強(qiáng)RCC細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔27〕。是細(xì)胞凋亡發(fā)生的最為重要的生化特征，它負(fù)責(zé)大量底物的蛋白水解，抑制Caspase-3的活性可使細(xì)胞凋亡受到抑制，因而Caspase-3活性的改變是反映細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要參數(shù)。本研究結(jié)果表明對(duì)于耐藥的腎癌細(xì)胞，CDDP不能通過有效提高Caspase-3的活性而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)miR-137之后，Caspase-3活性明顯提高，證實(shí)miR-137可通過提高Caspase-3的活性而促進(jìn)凋亡，從而提高CDDP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。