尹智堅 李才銳 趙薇 馬麥聰 李娟 孫若梅 蓋建偉

(大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，云南 大理 671000)

角膜病是我國比較常見的致盲眼病，其中大部分患者可通過角膜移植復(fù)明，但角膜移植排斥反應(yīng)仍是患者復(fù)明失敗的首要原因〔1，2〕。角膜新生血管在角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)過程中起到了重要作用〔3〕?，F(xiàn)在共發(fā)現(xiàn)了20余個對血管內(nèi)皮細(xì)胞有效力的因子，其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強的出血管生成因子〔4〕。貝伐單抗為重組人源化抗VEGF的單克隆抗體，抗新生血管作用明顯，且相對經(jīng)濟(jì)，其用于治療眼部新生血管在國內(nèi)外已被廣泛認(rèn)可〔5〕。目前關(guān)于貝伐單抗治療板層角膜移植術(shù)后新生血管有效的給藥方法等問題尚存在許多爭議。眼部藥物常用給藥途徑包括滴眼液點眼及局部注射。滴眼液點眼由于滴眼液在眼表蒸發(fā)及淚道快速引流，同時由于淚膜、角膜、結(jié)膜上皮等屏障的阻擋，造成藥物作用時間短、局部濃度低、生物利用率低〔6〕。結(jié)膜下注射及層間注射可使藥物繞過淚膜及結(jié)膜上皮或角膜上皮屏障，在局部提供充足的藥物濃度，是比較理想的給藥方式。因此，本研究通過建立豬-兔異種板層角膜移植建立板層角膜移植術(shù)后新生血管模型，對比貝伐單抗通過滴眼液滴眼、結(jié)膜下注射、角膜基質(zhì)注射3種不同給藥方式探討兔板層角膜移植術(shù)術(shù)后新生血管的抑制作用，研究貝伐單抗對兔板層角膜移植術(shù)后新生血管的影響及適宜的給藥方式。

1 材料和方法

1.1材料 受體選用(2.5±0.3)kg健康新西蘭兔70只(雌雄兼有)，由大理大學(xué)實驗動物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)動物房飼養(yǎng)，裂隙燈顯微鏡檢查雙眼前節(jié)正常。供體選用新鮮完整的豬眼球。由大理海春生豬定點屠宰場提供。實驗前檢查豬眼角膜上皮完整，透明。主要試劑：貝伐珠單抗注射液(100 mg：4 ml/瓶)，瑞士羅氏制藥公司。硫酸慶大霉素注射液(2 ml：8萬U)，辰欣藥業(yè)股份有限公司。鹽酸丙美卡因滴眼液(15 ml∶75 mg)、妥布霉素滴眼液(5 ml，0.3%)、妥布霉素眼膏(3.5 g，0.3%)，均為比利時愛爾康公司。主要試劑和儀器：磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.3)，上海莼試生物技術(shù)有限公司。VEGF抗體(兔多抗)，上海碧云天生物技術(shù)有限責(zé)任公司。RS-1300超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司。手持式顯微鏡及手術(shù)顯微鏡，蘇州六六科技有限公司。電子分析天平(JA5003 型)，北京精科天平廠。全自動高壓蒸汽消毒器，日本SANYO公司。4℃，-20℃，冰箱青島海爾集團(tuán)。Leica輪轉(zhuǎn)式切片機，Leica儀器有限公司?？酒瑱C(KYP-1型)，天津航空機電公司。本研究符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)且獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2兔角膜移植術(shù)后新生血管模型建立 取新鮮豬眼去除豬眼球表面筋膜和肌肉組織，暴露眼球，使用生理鹽水充分沖洗后浸泡于 1∶1 000 的慶大霉素鹽水中 20 min，延角膜緣后3 mm剪下帶有鞏膜的角膜片，在手術(shù)顯微鏡下用8.5 mm環(huán)鉆在角膜中央鉆切，手術(shù)刀剖切厚度約為2/3兔角膜厚度的豬眼角膜制成植片。25%烏拉坦溶液4 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，術(shù)眼滴丙美卡因滴眼液數(shù)滴行表面麻醉，將兔右眼固定于手術(shù)顯微鏡下，按眼科手術(shù)常規(guī)消毒鋪巾，開瞼器開瞼，8.25 mm環(huán)鉆于兔角膜中央鉆切，手術(shù)刀剖切2/3～4/5角膜厚度的角膜組織，形成植床。將植片覆蓋于植床上，10-0縫線間斷縫合12針，包埋縫線。術(shù)畢，結(jié)膜囊內(nèi)涂妥布霉素眼膏，術(shù)后滴用妥布霉素4次/d。本研究中角膜移植術(shù)后14 d，66只兔角膜層間新生血管形成，4只兔死亡，說明兔角膜移植術(shù)后新生血管模型建立成功。

1.3動物分組及藥物處理 將造模成功的角膜移植術(shù)后新生血管兔(n=66)隨機分為實驗組(n=30，貝伐單抗0.1 ml)和對照組(n=30，生理鹽水0.1 ml)及空白對照組(n=6，未做任何處理)，實驗組及對照組根據(jù)給藥途徑不同隨機各分為3個亞組，即滴眼液滴眼組、結(jié)膜下注射組、角膜層間注射組各10只。

1.4角膜血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)量的測定

1.4.1角膜采集 給藥后1、7、14、21 d，空白對照組隨機取1只，實驗組及對照組每個亞組分別隨機選取2只兔處死，生理鹽水沖洗雙眼，清潔無菌紗布吸干，延角膜緣后3 mm剪下帶有鞏膜的角膜片，取材后樣本固定于4%多聚酶甲醛(PFA)溶液，待測。

1.4.2樣本處理 取材后固定于4%PFA溶液48 h，用各濃度的乙醇溶液反復(fù)脫水各30 min，放入配制好的二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ溶液中各浸泡15 min，以角膜標(biāo)本透明后處理成功。浸蠟：將待檢測標(biāo)本置于配制好的石蠟Ⅰ及石蠟Ⅱ溶液中各60 min。包埋：將石蠟?zāi)Ｗ由约訜岷蠓湃胂災(zāi)?，再倒入少許熔蠟進(jìn)行包埋處理。切片：將石蠟塊冷凍30 min后，用切片機4 μm厚度進(jìn)行切片。脫蠟：將切片放入配制好的二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ溶液中各浸泡15 min進(jìn)行脫蠟處理。水化：將切片浸于各梯度的酒精脫水各5 min，然后用PBS反復(fù)沖洗3次?？乖迯?fù)：將切片置于枸櫞酸緩沖液中，微波爐加熱5 min后自然冷卻，再用PBS沖洗3次。滅活：切片上滴加3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，常溫下放置15 min后用PBS沖洗3次，擦拭切片上殘留液體。染色：切片加入一抗(兔VEGF抗體)，于37℃溫箱中孵育2 h，結(jié)束后用PBS沖洗3次，擦去切片上殘余液體后加入二抗，37℃溫箱中孵育1 h。觀察：切片滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，顯微鏡下觀察并照相，陽性信號為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中可見棕黃色或棕褐色顆粒。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行重復(fù)測量方差分析、LSD-t檢驗、單因素方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同途徑給藥對兔角膜VEGF表達(dá)的影響 3種途徑給藥后14 d，實驗組兔角膜中VEGF表達(dá)的抑制作用最明顯，對照組3種途徑給藥后角膜中VEGF表達(dá)持續(xù)增加，給藥后7 d、14 d、21 d，實驗及對照組角膜VEGF表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組3種途徑給藥后1 d、7 d、14 d、21 d角膜VEGF表達(dá)同時間點比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。不同途徑給藥實驗組滴眼液滴眼、結(jié)膜下注射及角膜層間注射7 d、14 d、21 d角膜VEGF表達(dá)均低于空白對照組(0.511±0.020、0.520±0.016、0.550±0.018)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而1 d角膜VEGF表達(dá)與空白對照組(0.489±0.018)無顯著性差異(P>0.05)。

表1 不同途徑給藥對鼠角膜VEGF表達(dá)的影響

2.2免疫組化檢測各組角膜中VEGF蛋白表達(dá) 不同途徑給藥后，角膜切片中可見棕黃色或棕褐色顆粒，為VEGF染色后陽性信號。可見空白對照組及對照組7 d、14 d、21 d棕黃色顆粒逐漸增加，實驗組棕黃色顆粒逐漸減少，見圖1。

圖1 各組角膜組織中VEGF蛋白表達(dá)差異(免疫組化，×100)

3 討 論

角膜移植手術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)是造成移植失敗的最常見、最主要的原因。隨著對免疫排斥發(fā)生機制認(rèn)識的深入，發(fā)現(xiàn)角膜新生血管是眾多危險因素中的一個非常重要的危險因素〔7〕。正常角膜中低水平的促血管生成因子和高水平的抗血管生成因子的平衡狀態(tài)維持了角膜的透明性及無血管性，當(dāng)異體角膜移植后，該平衡被打破，促血管生成因子將會促進(jìn)新生血管的發(fā)生。其中，VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成因子〔8〕。大量研究顯示，通過拮抗VEGF可顯著減少新生血管的生成〔9～11〕。貝伐單抗作為一種重組人源化VEGF單克隆抗體，其抗體免疫球蛋白抗原(IgG)1可與VEGF受體(VEGFR)結(jié)合，抑制VEGF的生物活性，從而起到減少、消退新生血管的作用。與其他抗VEGF藥物相比，貝伐單抗因為是由倉鼠卵巢細(xì)胞經(jīng)過分子生物學(xué)技術(shù)加工而來，含有一部分鼠源性蛋白，分子量較大，約為149 kD，抗原性相對較低，作用時間長，價格較便宜。其作用效果與同類藥物等相當(dāng)，具有一定的性價比〔12〕。本研究采用豬-兔異種異體板層角膜移植的方式建模，避免了傳統(tǒng)穿透性角膜移植方式建模術(shù)后實驗動物局部感染，眼內(nèi)容物流出，并發(fā)眼部其他疾病的風(fēng)險，術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的時間及程度較其他方式未見明顯差別，是一種安全、有效的建模方式。本研究結(jié)果說明，不同方式給藥后對VEGF的拮抗作用效果相當(dāng)，較對照組VEGF的表達(dá)明顯下降，分析原因認(rèn)為可能各組VEGF拮抗已達(dá)到飽和，故而給藥后VEGF不同時間及不同給藥方式之間區(qū)別不明顯。而結(jié)膜下注射操作簡單，可在短時間內(nèi)達(dá)到較高的藥物濃度，是一種簡便易行的給藥方式，避免了長期滴眼液對眼表細(xì)胞的損傷及角膜層間注射對角膜基質(zhì)的損傷，作用持久，效果顯著。近年來，越來越多的血管生長相關(guān)因子被發(fā)現(xiàn)和證實〔13,14〕。迄今為止，已報道有21種血管抑制因子及17種血管生成因子〔15〕。其中許多已經(jīng)被明確與血管增生相關(guān)〔16～18〕。因此，本研究中貝伐單抗不能完全消退新生血管，角膜新生血管的生成及消退機制仍需進(jìn)一步研究，以期發(fā)現(xiàn)更為高效的抗角膜新生血管藥物。同時本研究也有一定的不足，存在實驗樣本量小、跟蹤時間短等不足，需要今后更深入的研究及討論。