劉晨 張祥 姚俊朝 榮金奎 劉紅軍 金治賓 王壘壘

(1滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外五科，河北 滄州 061000；2滄州市獻(xiàn)縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科；3鹽山阜德醫(yī)院急診科)

膠質(zhì)瘤是原發(fā)性顱內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，占顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤的50%～60%，具有高侵襲性及高致死性〔1,2〕。目前膠質(zhì)瘤的治療手段有手術(shù)、放療、化療，但由于其浸潤性生長方式及對(duì)放化療的耐受性，即便通過手術(shù)切除聯(lián)合放化療，其整體治療效果依舊欠佳，患者的中位生存期僅有10～14個(gè)月，5年生存率僅有5%〔3,4〕。因此，尋找新的可靠的治療靶點(diǎn)成為膠質(zhì)瘤研究的重點(diǎn)之一。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類非編碼RNA分子，長度超過200個(gè)核苷酸，通過參與基因的表達(dá)調(diào)控，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮致癌或抑癌作用〔5〕。研究表明，LncRNAs在膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中起重要作用，LncRNAs MALAT1高表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度、患者預(yù)后不良密切相關(guān)，LncRNA PLAC2可通過靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤中核糖體蛋白L36誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯〔6,7〕。LncRNA FAS-AS1可通過介導(dǎo)宿主基因Fas表達(dá)影響乳腺癌增殖能力〔8〕。然而，LncRNA FAS-AS1對(duì)膠質(zhì)瘤的影響尚不清楚。本研究旨在探討LncRNA FAS-AS1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Fas介導(dǎo)凋亡的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑與儀器 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251(貨號(hào)：YS-1302X)購自美國sciencell公司；胎牛血清(貨號(hào)：FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：KL-P0032)購自德國merck/sigma公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號(hào)：11668030)購自美國Life Technologies公司；siRNA-NC、siRNA-FAS-AS1及FAS-AS1、Fas、GAPDH引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；pcDNA3.1(貨號(hào)：PVT1004)購自武漢維克賽思科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：K1002S)購自美國Promega公司；CCK-8試劑(貨號(hào)：CK-04)購自日本同仁化學(xué)研究所；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)：S0185)購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；Fas抗體、Fas配體(FasL)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、GAPDH抗體(貨號(hào)：ab82419、ab15285、ab196495、ab104156、ab181602)購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號(hào)：0295G-HRP)購自美國Santa公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：Stat Fax-2100)購自美國Awareness公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：BD FACSCanto II)購自美國BD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 U251細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、90%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合率達(dá)80%以上時(shí)，用胰酶消化、傳代。取對(duì)數(shù)生長期U251細(xì)胞分為對(duì)照組、si-NC組、si-FAS-AS1組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-FAS-AS1組，對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，si-NC組、si-FAS-AS1組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-FAS-AS1組細(xì)胞使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA-FAS-AS1、pcDNA3.1和pcDNA3.1-FAS-AS1。

1.2.2qRT-PCR法檢測各組U251細(xì)胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達(dá)情況 將U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書，在熒光定量PCR儀上檢測FAS-AS1、Fas mRNA表達(dá)水平，以2-ΔΔCt法表示，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次。FAS-AS1上游引物：5′-ACCGTGAAGGCATAAAAGCAA-3′，下游：5′-TTTTGCGCTCACGACATGC-3′；Fas上游引物：5′-CCCGGACCCAGAATACCAAG-3′，下游：5′-AAGACAAAGCCACCCCAAGT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游：5′-TCTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。

1.2.3CCK-8法檢測各組U251細(xì)胞增殖情況 將U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測各孔吸光度(OD)值。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測各組U251細(xì)胞凋亡情況 將U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，使用400 μl 1×結(jié)合緩沖液調(diào)整成細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒操作說明書步驟，分別加入Annexin V-FITC、PI各5 μl，避光孵育1 h，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western印跡法檢測各組U251細(xì)胞中Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況 將U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，加入Fas抗體(1∶500)、FasL抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶500)、Bax抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，拍攝圖像，分析條帶灰度，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度/內(nèi)參GAPDH條帶灰度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組U251細(xì)胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達(dá)情況 對(duì)照組、si-NC組、pcDNA3.1-NC組U251細(xì)胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與si-NC組相比，si-FAS-AS1組U251細(xì)胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-FAS-AS1組U251細(xì)胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組U251細(xì)胞增殖情況 對(duì)照組、si-NC組、pcDNA3.1-NC組U251細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與si-NC組相比，si-FAS-AS1組U251細(xì)胞OD值顯著升高(P<0.05)。與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-FAS-AS1組U251細(xì)胞OD值顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3各組U251細(xì)胞凋亡情況 對(duì)照組、si-NC組、pcDNA3.1-NC組U251細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與si-NC組相比，si-FAS-AS1組U251細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-FAS-AS1組U251細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組U251細(xì)胞OD值、凋亡率、FAS-AS1、Fas mRNA及Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組U251細(xì)胞凋亡情況

2.4各組U251細(xì)胞中Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況 對(duì)照組、si-NC組、pcDNA3.1-NC組U251細(xì)胞中Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與si-NC組相比，si-FAS-AS1組U251細(xì)胞中Fas、FasL、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-FAS-AS1組U251細(xì)胞中Fas、FasL、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

1～5：對(duì)照組、si-NC組、si-FAS-AS1組、pcDNA3.1-NC組、pcDNA3.1-FAS-AS1組

3 討 論

膠質(zhì)瘤是最常見的來源于神經(jīng)上皮組織的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高，治愈率低。手術(shù)切除聯(lián)合放化療是膠質(zhì)瘤治療的主要方法，但存在一定局限性，高級(jí)別的膠質(zhì)瘤患者易在術(shù)后復(fù)發(fā)，平均生存期低于15個(gè)月〔9〕。LncRNA可通過影響RNA的轉(zhuǎn)錄、剪切、降解等生物學(xué)過程，調(diào)節(jié)多種生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA的異常表達(dá)在各種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且一些LncRNA可作為膠質(zhì)瘤的潛在腫瘤標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)〔11,12〕。

FAS-AS1是Fas的反義LncRNA，以反義的方式從人類染色體上的Fas基因中轉(zhuǎn)錄出來，通過影響RNA剪接調(diào)控Fas，與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)〔13〕。研究表明，F(xiàn)AS-AS1可通過Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號(hào)途徑在紅細(xì)胞生成過程中起重要作用〔14〕。Zhu等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，降低FAS-AS1的表達(dá)可抑制軟骨細(xì)胞凋亡并促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。Yang等〔16〕研究表明，F(xiàn)AS-AS1在非小細(xì)胞肺癌中顯著下調(diào)，能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程。本研究結(jié)果顯示，成功下調(diào)U251細(xì)胞中FAS-AS1表達(dá)水平后，U251細(xì)胞OD值顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；反之，U251細(xì)胞OD值顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示FAS-AS1可促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，但其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

Fas是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)的經(jīng)典受體之一，與其配體FasL結(jié)合后可形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8及Caspase家族其他成員，在腫瘤細(xì)胞增殖、降解、凋亡過程中發(fā)揮重要作用〔17〕。王曉麗等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as/FasL通路活化可導(dǎo)致下游Caspase途徑的活化，介導(dǎo)17-羥-巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡過程。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AS-AS1作為Fas的反義轉(zhuǎn)錄本，成功下調(diào)U251細(xì)胞中FAS-AS1表達(dá)水平后，U251細(xì)胞中Fas mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)水平亦顯著降低；反之，U251細(xì)胞中Fas mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)水平亦顯著升高，提示FAS-AS1可影響Fas/FasL通路活化。Bcl-2家族蛋白在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中，抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax是該家族重要成員〔19〕。本研究結(jié)果顯示，成功下調(diào)U251細(xì)胞中FAS-AS1表達(dá)水平后，U251細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高；反之，U251細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示FAS-AS1通過影響B(tài)ax、Bcl-2蛋白水平，調(diào)控U251細(xì)胞增殖、凋亡過程，推測FAS-AS1通過激活Fas/FasL通路，可能經(jīng)由Caspase家族途徑，影響凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2水平，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)U251細(xì)胞的凋亡促進(jìn)、增殖抑制作用〔20〕。

綜上所述，LncRNA FAS-AS1可以激活Fas/FasL通路，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，可作為膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)。