蘇振宇 李小兵 李紅方 黃建成 呂瑛

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心外科，河北 石家莊 050031)

2型糖尿病(T2DM)是一種全球性的流行病，糖尿病患者患心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)是非糖尿病患者的兩倍以上，老年糖尿病患者心力衰竭發(fā)病率接近 22%，糖尿病患者心力衰竭發(fā)病率的增加即使在排除年齡、高血壓、高膽固醇血癥和冠心病(CAD)等其他危險(xiǎn)因素后仍然存在〔1〕。研究表明，44%的心力衰竭住院患者患有糖尿病，合并疾病的共存增加了臨床治療難度〔2〕。雖然糖尿病合并心力衰竭患者的死亡率與血紅蛋白(HbA)呈U形相關(guān)，HbA水平為7.1%的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)最低，但與非糖尿病合并心力衰竭患者相比，糖尿病患者的死亡和再住院風(fēng)險(xiǎn)更大。此外，較高的HbA水平與心力衰竭發(fā)病率增加有關(guān)〔2〕。心肌細(xì)胞凋亡是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，心力衰竭和心肌衰老等疾病均有大量心肌細(xì)胞凋亡〔3〕。心肌細(xì)胞上有多種離子通道參與心肌的正常代謝，如鈉、鉀、鈣、氯離子等，也與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔4〕。高糖可誘發(fā)心肌損傷的發(fā)生，可能與氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種因素有關(guān)〔5〕。氯離子通道包括囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)因子(CFRP)氯離子通道、鈣激活氯離子通道(CaCC)等。研究表明氯離子通道具有調(diào)節(jié)細(xì)胞容積及細(xì)胞內(nèi)pH 值、維持細(xì)胞靜息膜電位、調(diào)控細(xì)胞活性與分化等多種生物學(xué)功能，也可參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等過程〔3〕。氯離子通道阻斷劑4(DIDS)是CaCC抑制劑，也是研究心肌損傷的常用抑制劑，可以抑制多種凋亡誘導(dǎo)劑導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，其中，Caspase-3是凋亡過程中最主要的終末剪切酶。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)基因是一種原癌基因，可以通過多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡，包括抗氧化作用，Bcl-2高表達(dá)可以減少活性氧(ROS)的產(chǎn)生。Bcl-2還可以抑制凋亡蛋白酶Caspase激活，維持鈣穩(wěn)態(tài)。Bcl-2不僅是Caspase-3的上游基因，還可以作為其底物〔6〕。高血糖可增加自由基和促炎性細(xì)胞因子的生成，進(jìn)一步促進(jìn)AKT的激活，增加培養(yǎng)心肌細(xì)胞的凋亡〔7〕。缺血期間的急性高血糖會損害心肌細(xì)胞中AKT的激活〔8〕。高血糖抑制AKT信號可使胰島素產(chǎn)生抵抗作用〔8〕。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是一種重要的應(yīng)激信號分子，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)〔9〕。胰島素抵抗和(或)2型糖尿病患者血漿游離脂肪酸、炎性細(xì)胞因子和(或)葡萄糖水平高，可激活p38 MAPK〔10〕。一旦p38 MAPK途徑被激活，它就能夠破壞細(xì)胞，從而進(jìn)一步提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平。本文重點(diǎn)探討氯離子/MAPK/AKT信號通路對高糖引起的心肌細(xì)胞損傷的影響。

1 材料和方法

1.1材料 0～3 d SD仔鼠購自空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動物中心。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)購自美國sigma公司；DIDS購自上海生工公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、氯離子熒光探針N-〔6-甲氧喹諾基〕乙酰乙酯(MQAE)、超氧化物陰離子熒光探針(DHE)、羊抗兔抗Caspase-3(貨號ab29422)抗體、羊抗兔抗GAPDH抗體(貨號ab13522)購自Sigma公司。過氧化物酶復(fù)合物(SABC)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購自武漢博士德公司。

1.2方法

1.2.1心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定和分組處理〔11,2，4〕取出生1 d的大鼠乳鼠10只，70%乙醇消毒皮膚，剪開胸腔，去除血污與大血管，取出心臟，操作時(shí)應(yīng)避免拉扯心臟造成的損傷。取下的心臟置于4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，清洗，剪至1 mm3左右的組織碎塊，慢慢洗凈組織中殘余的血液。加入1 mg/ml的Ⅰ型膠原蛋白酶(0.22 μm過濾除菌)消化組織(37℃)。每次消化時(shí)間約7 min，加入與酶液等體積含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心(200 μg，5 min)收集心室肌細(xì)胞，組織進(jìn)行多次消化，但不超過8次。收集所有得到細(xì)胞，重懸細(xì)胞，200目濾網(wǎng)過濾后再接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清和終濃度0.1 mmol/L BrdU的DMEM培養(yǎng)基。

采用抗α-肌動蛋白(α-actin)抗體進(jìn)行鑒定，將細(xì)胞以3×105/孔細(xì)胞數(shù)接種于預(yù)先放有消毒蓋玻片的12孔板(用0.01 g/L多聚賴氨酸處理30 min，以促進(jìn)細(xì)胞黏附)；置于37℃、50 ml/L CO2，飽和濕度孵箱中孵育。取出蓋玻片，用預(yù)冷(-20℃)的固定液(甲醛∶丙酮1∶1)固定8 min；滴加一抗(Caspase-3，GAPDH，α-actin)，1∶100(PBS稀釋)，放于濕盒中4℃過夜；PBS(pH7.4)漂洗3 min×3次；滴加二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)發(fā)光羊抗兔〕，1∶100(PBS稀釋)，室溫放置37℃ 30 min；滴加SABC復(fù)合物，濕盒內(nèi)37℃孵育20 min；DAB顯色：滴加新鮮配制的DAB顯色劑，在鏡下觀察顯色后，流水沖洗終止顯色反應(yīng)，蘇木素核復(fù)染；常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。分組：培養(yǎng)1 h后，加入終濃度為100 μmol/L 的BrdU進(jìn)行培養(yǎng)。將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分為3組：對照組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組。高糖組高糖DMEM培養(yǎng)基(33 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)；對照組DMEM培養(yǎng)基(含有5.5 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組高糖DMEM培養(yǎng)基(含有33 mmol/L葡萄糖)和100 μmol/L DIDS處理〔5，7〕。

1.2.2氯離子熒光探針MQAE檢測心肌細(xì)胞氯離子濃度 采用MQAE檢測細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度(檢測原理：當(dāng)細(xì)胞外的氯離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞內(nèi)的MQAE被熒光淬滅)，將按上述方法分組的心肌細(xì)胞接種于48孔板中，處理后吸棄培養(yǎng)基。每孔加入100 μl 10 mmol/L MQAE工作液，孵育1 h，倒置熒光顯微鏡進(jìn)行熒光檢測，記錄并計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.2.3MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞存活率和心肌細(xì)胞凋亡率 將心肌細(xì)胞以5×105個(gè)/ml濃度接種于96孔板中，100 μl/孔。按照上述方法處理后，加10 μl劑量為5 mg/ml的MTT溶液與100 μl無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育4 h，每孔加150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上計(jì)算細(xì)胞存活率(波長490 nm)。PBS洗滌2次，用胰蛋白酶消化心肌細(xì)胞(不含EDTA)，收集1×106個(gè)細(xì)胞，重懸細(xì)胞后，選擇膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測與計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.4超氧化物陰離子熒光染色檢測心肌細(xì)胞ROS含量 將細(xì)胞接種于含蓋玻片的24孔板中，按上述方法處理72 h。吸出培養(yǎng)基，固定、洗滌、封閉。每片加50 μl DHE(5 μmol/L)，37℃避光孵育10 min，封片后在鏡下記錄與觀察綠色熒光強(qiáng)度，記錄與計(jì)算ROS水平。

1.2.5Western印跡 3組細(xì)胞3經(jīng)處理后，在冰冷裂解緩沖液中裂解。用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。使用以下主要抗體：anti-Bcl-2、anti-Caspase-3、anti-p-AMPK、anti-p-AKT 和anti-GAPDH。將膜與HRP結(jié)合的抗兔IgG抗體(1∶5 000稀釋；CST，美國)孵育1 h，然后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(Santa Cruz，美國)和放射自顯影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行配對樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1抑制氯離子可顯著降低高糖誘導(dǎo)所致心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子升高的水平 與對照組相比，高糖組氯離子濃度顯著升高(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組氯離子濃度顯著低于高糖組(P<0.05)。見表1。

2.2抑制氯離子增加高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性和降低心肌細(xì)胞凋亡 與對照組相比，高糖組心肌細(xì)胞活性顯著減少(P<0.05)。與高糖組相比，實(shí)驗(yàn)組的心肌細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。流式細(xì)胞數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組心肌細(xì)胞凋亡率相比，高糖組明顯升高(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于高糖組 (P<0.05)。見表1、圖1。

2.3抑制氯離子濃度降低高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS 與對照組相比，高糖組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成顯著增加(P<0.05)；與高糖組心肌細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 生成顯著減少(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 抑制氯離子濃度降低高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生(DHE染色，×100)

2.4抑制氯離子濃度對心肌細(xì)胞Bal-2和Caspase-3水平的影響 與對照組相比，高糖組心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)顯著降低，Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與高糖組相比，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2顯著升高，Caspase-3蛋白表達(dá)水平則顯著降低(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 3組心肌細(xì)胞Bcl-2和Caspase-3表達(dá)水平

2.5抑制氯離子濃度對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞MAPK/AKT信號通路 與對照組相比，高糖組心肌細(xì)胞內(nèi)p-MAPK表達(dá)增加，而顯著抑制p-AKT蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；與高糖組相比，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞內(nèi)p-MAPK被顯著抑制，而p-AKT水平則顯著激活(P<0.05)。見表1、圖4。

表1 3組細(xì)胞內(nèi)氯離子水平心肌細(xì)胞活性、凋亡率及心肌細(xì)胞ROS、Bal-2、Caspase-3、p-MAPK、p-AKT水平表達(dá)

圖4 3組心肌細(xì)胞MAPK/AKT信號通路表達(dá)水平

3 討 論

糖尿病患病人數(shù)的增加可能是造成心血管疾病發(fā)病率居高不下的重要的原因之一〔12〕。糖尿病很早就被確定是心力衰竭的重要危險(xiǎn)因素，高血糖在糖尿病心肌病形成過程中起到了關(guān)鍵作用。慢性高血糖既可以引起心肌細(xì)胞肥大、壞死和凋亡，其中有直接和間接的機(jī)制〔12〕。慢性高血糖可以通過電子鏈?zhǔn)筊OS產(chǎn)生增多，后者可以誘發(fā)心肌細(xì)胞的凋亡〔13〕。ROS 可以激活聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(PARP)，引起糖基化增加并抑制GAPDH，使糖酵解過程轉(zhuǎn)變?yōu)橐鹦募〖?xì)胞損傷的級聯(lián)反應(yīng)。這其中包括糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生增加及己糖胺通路和多元醇通路的激活、蛋白激酶(PK)C的產(chǎn)生增加。高血糖引起的 ROS、PARP、糖基化終末產(chǎn)物、醛糖還原酶產(chǎn)生增加均可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔13〕。 氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的重要機(jī)制。高糖條件下大鼠胚胎的體外培養(yǎng)顯示，暴露于高糖后，谷胱甘肽耗盡、活性氧生成過多、生長遲緩和嚴(yán)重畸形〔12〕。使用抗氧化劑如丁羥甲苯、維生素C和E治療可降低大鼠顱面畸形和骨骼畸形的發(fā)生率，而維生素E可降低大鼠冠心病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，這提示ROS可能參與大鼠冠心病的進(jìn)程〔14〕。心肌細(xì)胞的凋亡是心肌損傷的主要病理改變，可造成心肌的修復(fù)性纖維化。其中容積調(diào)節(jié)性氯通道不但可被細(xì)胞腫脹、改變細(xì)胞外液滲透壓所激活。本課題發(fā)現(xiàn)，抑制氯離子濃度促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性和心肌細(xì)胞凋亡。高糖刺激可對心肌細(xì)胞產(chǎn)生直接或間接作用，通過多種機(jī)制造成心肌損傷，根據(jù)此原理建立心肌損傷的細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示氯離子通道阻斷后，能夠有效減少心肌損傷造成的心肌細(xì)胞凋亡。本研究表明在心肌損傷環(huán)境中，氯離子外流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。氯離子通道被阻斷后，損傷環(huán)境下心肌細(xì)胞中ROS 的生成量顯著減少。容積調(diào)節(jié)性氯通道除參與調(diào)節(jié)細(xì)胞容積外，在胞內(nèi)酸堿平衡、細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程中起重要作用。氯離子可能影響ROS及其氧化應(yīng)激的作用。研究表明Bcl-2與Caspase家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起重要作用〔15〕。其中，Caspase-3是凋亡過程的主要執(zhí)行者，活化的Caspase-3可經(jīng)蛋白酶解過程激活后，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2是凋亡程序中的重要調(diào)控基因之一，在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)時(shí)可抑制凋亡〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制氯離子濃度通過調(diào)控Bcl-2和Caspase-3抑制心肌細(xì)胞凋亡。體外研究證明，同源類似物A/Rho相關(guān)激酶(RhoA/ROCK)途徑可通過氧化應(yīng)激JNK和p38 MAPK通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔16，17〕。本研究發(fā)現(xiàn)，氯離子可以通過調(diào)控 MAPK/AKT信號通路抑制高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

綜上，抑制氯離子可降低高糖所致心肌細(xì)胞內(nèi)ROS和Caspase-3水平，升高Bcl-2，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞活性，導(dǎo)致的心肌損傷得到修復(fù)。抑制氯離子可以通過調(diào)控 MAPK/AKT信號通路抑制高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。