王磊 沈玉杰 涂韶恒 肖李秋 賀達(dá)

(武漢市普仁醫(yī)院疼痛科,湖北 武漢 430000)

神經(jīng)病理性疼痛(NP)屬于損傷或疾病作用于軀體感覺系統(tǒng)引起的一種疼痛，其中脊髓背部自噬受損作為加重NP的主要原因之一，會加重NP〔1〕。NP病理生理過程機(jī)制復(fù)雜，目前尚缺乏有效的治療方法〔2〕。各種藥物治療尚存在一定的不良反應(yīng)，電針治療NP安全、簡便且無不良反應(yīng)，臨床上已證實(shí)可有效緩解疾病，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究〔3，4〕。電針可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，可以修復(fù)損傷神經(jīng)根從而緩解神經(jīng)根型頸椎病〔5〕，在NP中電針是否發(fā)揮類似作用尚無相關(guān)研究。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1-叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(FOX)O1通路調(diào)控細(xì)胞的自噬活動(dòng)，進(jìn)而影響細(xì)胞功能，推測電針可能通過SIRT1-FOXO1通路在NP中影響自噬。本研究通過坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(CCI)建立NP模型，電針處理后添加SIRT1抑制劑，初步探討電針保護(hù)NP的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只健康雄性SD大鼠購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)-2018-0004，SPF級，體重(210±10)g。所有大鼠在溫度(24±1)℃、濕度(55±5)%、自然光照條件下自由飲水?dāng)z食，定期通風(fēng)，并更換墊料，在本研究中心暫養(yǎng)7 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核并批準(zhǔn)。

1.2試劑與儀器 4-0鉻制羊腸線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司)；SIRT1抑制劑(selisistat，EX-527，上海陶素生化科技有限公司，貨號：T6111)；山羊抗兔IgG H&L異硫氰酸熒光素(FITC)、一抗SIRT1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3、FOXO1(英國abcam公司，貨號分別為：ab6717、ab189494、ab192890、ab52857)；電子Von Frey刺激針(英國Bioseb公司，型號：EVF3)；熱痛敏刺激儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司，型號：7280)；多功能電針治療儀(蘇州華倫醫(yī)療用品有限公司，型號：SH-1)；透射電鏡(賽默飛世爾，型號：Glacios Cryo-TEM)；蛋白凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司，型號：GelDoc EZ)。

1.3動(dòng)物分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、電針組、電針+抑制劑組，每組12只。除假手術(shù)組外，其余各組參考文獻(xiàn)〔6〕建立CCI所致NP大鼠模型，大鼠麻醉后切開右肢皮膚，分離肌肉，暴露出坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)中段用4-0鉻制羊腸線扎4圈。大鼠出現(xiàn)跛行、足輕微外翻狀，有時(shí)出現(xiàn)舔舐、懸空等現(xiàn)象，表明模型建立成功。假手術(shù)組不對坐骨神經(jīng)線扎，其余步驟與模型相同，實(shí)驗(yàn)每天注射青霉素防止感染。

造模成功第7天參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》〔7〕大鼠穴位圖譜，電針組多功能電針治療儀選用“環(huán)跳”“陽陵泉”穴電針，給予疏密波2 Hz/100 Hz交替，強(qiáng)度≤1 mA，時(shí)間30 min〔8〕；電針+抑制劑組在電針組基礎(chǔ)上分別在第7天、第10天、第14天脊髓鞘內(nèi)注射SIRT1抑制劑EX-527〔溶于8%二甲基亞砜(DMSO)，2 mg/kg注射〕各1次。假手術(shù)組和模型組鞘內(nèi)注射等體積DMSO。

1.4機(jī)械縮足反射閾值(MWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(PWTL)測定 造模前、造模后給藥前、給藥后測定MWT和PWTL來評價(jià)大鼠機(jī)械性觸發(fā)痛和熱痛覺過敏。Von Frey纖維絲以up-down法〔9〕推算50%機(jī)械縮足閾值：所有大鼠置于有機(jī)透明玻璃箱中限制其活動(dòng)，玻璃箱長20 cm、寬12 cm、高20 cm，箱底放0.5 cm×0.5 cm網(wǎng)格鐵絲網(wǎng)。電子Von Frey刺激針刺激大鼠右足底，從1.0 g開始，逐漸增加纖毛折力，每次間隔30 s，最大力度為15 g，大于此值記為15 g，反射的最小刺激強(qiáng)度即為MWT。每次實(shí)驗(yàn)平行3次，平均值即為MWT。MWT結(jié)束后適應(yīng)1 h，參考Hargeeaves法〔10〕熱痛敏刺激儀照射大鼠右足底，大鼠出現(xiàn)快速抬足或添足行為時(shí)停止實(shí)驗(yàn)，記錄輻射照射的持續(xù)時(shí)間，自動(dòng)間隔時(shí)間30 s，避免灼傷足部，每次實(shí)驗(yàn)平行3次，平均值即為PWTL。

1.5免疫熒光檢測脊髓SIRT1蛋白表達(dá) 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取6只大鼠，麻醉后于左心室-主動(dòng)脈插入灌注針，200～250 ml生理鹽水快速?zèng)_洗血液，至心、肝、肺變白后，更換為4℃、4%多聚甲醛250 ml灌注，整個(gè)灌注過程持續(xù)1 h。4%多聚甲醛固定后，暴露脊髓，找到第4、5、6腰椎，并在錐孔處找到腰椎神經(jīng)節(jié)，取出第4～5脊髓節(jié)段，置于4℃、4%多聚甲醛固定6 h后轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中脫水48 h至組織沉底。組織切片(厚度25 μm、3 μm兩種規(guī)格)。25 μm切片經(jīng)0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，加入羊血清封閉液封閉2 h，更換為一抗SIRT1，4℃封閉48 h，PBS漂洗；添加FITC標(biāo)記的二抗，37℃封閉2 h，PBS漂洗，避光貼片，37℃烘干后甘油封片，共聚焦顯微鏡攝片。

1.6透射電鏡下觀察脊髓超微結(jié)構(gòu) 3 μm切片用飽和醋酸鈾-醋酸鉛雙重染色，自然條件下干燥，透射電鏡下觀察脊髓超微結(jié)構(gòu)，每張切片10個(gè)視野，觀察自噬小體形態(tài)及數(shù)量變化。

1.7Western印跡檢測脊髓中LC3、SIRT1、FOXO1蛋白水平 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組剩余6只大鼠麻醉后分離出脊髓，取出第4～5脊髓節(jié)段，取部分加入RIPA裂解液后超聲勻漿1 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，上清液為總蛋白，BCA法測定總蛋白，凝膠電泳上樣總蛋白量20 μg分離蛋白，聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別添加一抗(SIRT1、FOXO1、LC3、GAPDH)，4℃孵育過夜；添加對應(yīng)二抗，室溫封閉2 h，ECL顯影，蛋白凝膠系統(tǒng)定量分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1電針對大鼠行為學(xué)的影響 造模前，各組MWT、PWTL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后給藥前，與假手術(shù)組相比，模型組、電針組、電針+抑制劑組MWT、PWTL明顯降低(P<0.05)。給藥后，與假手術(shù)組相比，模型組MWT、PWTL明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組MWT、PWTL明顯升高(P<0.05)；與電針組相比，電針+抑制劑組MWT、PWTL明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組MWT、PWTL比較

2.2免疫熒光檢測電針對脊髓SIRT1蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組(1.01±0.11)相比，模型組SIRT1蛋白免疫熒光強(qiáng)度(0.53±0.06)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組SIRT1蛋白免疫熒光強(qiáng)度(0.89±0.11)明顯升高(P<0.05)；與電針組相比，電針+抑制劑組SIRT1蛋白免疫熒光強(qiáng)度(0.39±0.05)明顯降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫熒光檢測各組脊髓SIRT1蛋白表達(dá)(×200)

2.3電針對脊髓超微結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組可見完整的細(xì)胞膜或線粒體，自噬小體雙膜結(jié)構(gòu)完整；模型組出現(xiàn)線粒體腫脹破裂現(xiàn)象，且與溶酶體融合，未發(fā)現(xiàn)明顯的自噬小體；電針組線粒體結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，自噬小體數(shù)量多，雙膜包裹里可見少量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片；電針+抑制劑組自噬小體數(shù)量較電針組明顯減少，自噬小體部分出現(xiàn)單膜結(jié)構(gòu)。見圖2。

圖2 透射電鏡觀察各組脊髓超微結(jié)構(gòu)(飽和醋酸鈾鄄醋酸鉛雙重染色，×10 000)

2.4電針對脊髓中LC3蛋白水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組脊髓中LC3Ⅰ蛋白水平明顯升高，LC3Ⅱ蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組LC3Ⅰ蛋白水平明顯降低，LC3Ⅱ蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯升高(P<0.05)；與電針組相比，電針+抑制劑組LC3Ⅰ蛋白水平明顯升高，LC3Ⅱ蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯降低(P<0.05)。見表2、圖3。

1～4：假手術(shù)組、模型組、電針組、電針+抑制劑組；圖4同

2.5電針對脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平升高(P<0.05)；與電針組相比，電針+抑制劑組脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平降低(P<0.05)。見表2、圖4。

表2 各組脊髓中LC3、SIRT1、FOXO1蛋白水平比較

圖4 Western印跡檢測各組脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平

3 討 論

NP涉及多種細(xì)胞、分子和通路過程，而自噬廣泛參與生理病理過程，對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用，且近年來自噬與NP的發(fā)生發(fā)展成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)〔11〕。自噬對于神經(jīng)元的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要，可以對環(huán)境變化做出反應(yīng)從而免受環(huán)境改變和病理刺激，在NP中促進(jìn)自噬可促使蛋白質(zhì)和細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換，對于維持突觸完整性和可塑性等具有至關(guān)重要的作用〔12〕。NP中醫(yī)屬痹癥范疇，環(huán)跳、陽陵泉穴位深層解剖為坐骨神經(jīng)及其分支，電針刺激穴位臨近神經(jīng)及其周圍血管，可以促進(jìn)血液循環(huán)，改善局部癥狀〔13〕，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示NP大鼠對刺痛、熱痛的敏感性降低，可能是NP本身疼痛降低對外界的反應(yīng)；脊髓自噬小體數(shù)量少，機(jī)體神經(jīng)修復(fù)作用降低，不能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。而電針提高對痛的敏感性，并可增加自噬小體數(shù)量，從而促使蛋白質(zhì)和細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)化等，進(jìn)而維持環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，對于NP具有保護(hù)作用，但機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

SIRT1屬煙酰腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶，在各組織中廣泛存在，作用機(jī)制研究較清晰，屬FOXO1轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要調(diào)節(jié)因子；而FOXO1與自噬關(guān)系密切，激活SIRT1可以活化FOXO1從而調(diào)節(jié)自噬〔14〕。FOXO1屬轉(zhuǎn)錄因子的叉頭家族，具有保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，SIRT1可以增強(qiáng)FOXO1的DNA親和力〔15〕。本研究結(jié)果提示，NP中SIRT1-FOXO1通路受到抑制，機(jī)體處于自噬抑制狀態(tài)。細(xì)胞中正常情況下LC3加工成胞質(zhì)可溶性LC3Ⅰ；當(dāng)機(jī)體發(fā)生自噬時(shí)，LC3Ⅰ經(jīng)過泛素化樣加工和修飾，與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合成LC3Ⅱ，特異性表達(dá)于自噬小體膜上，是自噬小體的分子標(biāo)志，對于自噬的檢測具有重要意義〔16，17〕。本研究結(jié)果提示NP中自噬的標(biāo)志性蛋白合成處于抑制狀態(tài)，此時(shí)自噬狀態(tài)較弱。而電針刺激后可升高LC3Ⅱ水平，促進(jìn)自噬小體的生成。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SIRT1可以促進(jìn)FOXO1和FOXO3a的活性，增強(qiáng)DNA親和力，入核與Atg8、Atg12的啟動(dòng)子序列結(jié)合，促進(jìn)LC3的去乙?；?，促進(jìn)LC3的核質(zhì)轉(zhuǎn)移和自噬體的形成過程〔18～20〕，推測SIRT1可能促進(jìn)FOXO1的表達(dá)從而促進(jìn)LC3Ⅱ蛋白形成，促進(jìn)自噬體的形成。本研究結(jié)果提示，電針通過激活SIRT1-FOXO1通路促進(jìn)LC3Ⅱ蛋白形成，進(jìn)而促進(jìn)自噬小體形成。在電針的基礎(chǔ)上添加SIRT1抑制劑，脊髓中SIRT1-FOXO1通路受到抑制，LC3Ⅱ蛋白水平降低，刺痛、熱痛的敏感性又降低，進(jìn)一步提示電針可能通過激活SIRT1-FOXO1通路進(jìn)而促進(jìn)自噬形成，從而實(shí)現(xiàn)對NP的保護(hù)。