梁爽 鐘珊 何博 任馳 羅曉舟 楊雪捷 唐純志 羅倫

(1成都市第二人民醫(yī)院，四川 成都 610000；2成都市第三人民醫(yī)院；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)；4廣州中醫(yī)藥大學(xué))

高血壓作為認知功能障礙的危險因素之一，近年來得到學(xué)界的廣泛關(guān)注〔1,2〕。海馬與心血管控制的中樞，如下丘腦、延髓、孤束核等有著密切和復(fù)雜的跨突出聯(lián)系〔3〕。針刺太沖、太溪對血壓的調(diào)節(jié)作用已在研究中得到了證實〔4～6〕。本研究擬驗證針刺降低自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血壓，探討其對認知功能損害的預(yù)防調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 SPF級11周齡雄性SHR(12只，動物合格證編號11400700183999)和WKY大鼠(對照組)(6只，動物合格證編號11400700184002)，購自北京維通利華公司。其中SHR以血壓為分層條件，按照隨機區(qū)組設(shè)計分為模型組和針刺組。WKY大鼠不分組。

1.2針刺方法 在大鼠清醒狀態(tài)下行針刺，左右兩側(cè)穴位同時進行，先左后右各2.5 min。針刺1次/d，連續(xù)針刺4 w。針刺時，將黑色棉襪罩住大鼠，此時大鼠處于黑暗環(huán)境，可保持安靜穩(wěn)定狀態(tài)。所有操作由固定一人進行。對照組與模型組不給予針刺。

1.3血壓測量方法 采用無創(chuàng)動物血壓測量系統(tǒng)測量大鼠的尾動脈血壓。實驗前后后各測定一次血壓。測量時保持周圍環(huán)境安靜，連續(xù)測量3次，取平均值。

1.4Y型迷宮實驗 干預(yù)后行Y型迷宮測試。Y型迷宮分為起步區(qū)、安全區(qū)和非安全區(qū)。其中安全區(qū)指示燈亮起，金屬柵欄無電流。非安全區(qū)和起步區(qū)指示燈熄滅，金屬柵欄有電流，電壓約40 V。實驗開始后安全區(qū)指示燈亮起，另外兩區(qū)延遲2 s后開始通電。大鼠若能在燈光亮起時成功由起步區(qū)跑向安全區(qū)則記為正確一次，否則記錄為錯誤。時隔5 s進行第二次實驗，重復(fù)測試10次，若能正確9次，則為學(xué)會，這10次測試之前的測試次數(shù)為學(xué)會次數(shù)。100次后仍然未學(xué)會則學(xué)會次數(shù)為100次。24 h后再次進行實驗，重復(fù)測試10次，若正確9次，則為記住，這10次測試之前的測試次數(shù)為記憶次數(shù)。100次后仍然未學(xué)會則記憶次數(shù)為100次。

1.5標(biāo)本采取 最后一次針刺后1 d取材。各組取3只大鼠，水合氯醛麻醉后，固定解剖板，開胸，分離心臟，以九號針頭自心尖部刺入左室，止血鉗固定針頭，剪開右心，先以足量生理鹽水進行灌注，直至肝臟完全變白，后用4%的多聚甲醛灌注。然后取出大腦投入4%的多聚甲醛溶液固定。

1.6病理形態(tài)學(xué)檢測方法

1.6.1蘇木素-伊紅(HE)染色 ①石蠟切片脫蠟至水；②蘇木素染細胞核；③伊紅染細胞質(zhì)；④脫水封片；⑤圖像采集分析。

1.6.2尼氏染色 ①石蠟切片脫蠟至水;②甲苯胺藍染色;③95%酒精分化；④中性樹膠封片；⑤圖像采集分析。

1.7儀器與試劑 無菌針灸針(蘇州市華倫醫(yī)療用品有限公司)；脫水機；包埋機；病理切片機；凍臺；組織攤片機；烤箱；載玻片及蓋玻片；正置光學(xué)顯微鏡；成像系統(tǒng)。無水乙醇；二甲苯；HE染液；鹽酸；氨水；甲苯胺藍染色試劑；中性樹膠。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用STATA14.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，非參數(shù)Bonferroni法兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1干預(yù)前后血壓測量結(jié)果 干預(yù)前后各組血壓差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)前后模型組與對照組相比血壓水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；針刺組與模型組相比血壓水平有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。模型組和針刺組血壓水平顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2干預(yù)前后行為學(xué)實驗結(jié)果 干預(yù)后各組學(xué)習(xí)次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。干預(yù)后模型組與對照組相比學(xué)習(xí)次數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；針刺組與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組與針刺組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組和針刺組學(xué)習(xí)次數(shù)顯著高于模型組(P<0.05)。干預(yù)后各組記憶次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 干預(yù)前后3組血壓及學(xué)習(xí)記憶情況

2.3干預(yù)后病理學(xué)實驗結(jié)果 模型組海馬區(qū)大量神經(jīng)元細胞核固縮、深染，部分神經(jīng)元細胞核消失；針刺組部分神經(jīng)元細胞核固縮、深染(箭頭所示)；對照組個別神經(jīng)元細胞深染。模型組大量神經(jīng)元細胞深染，較多細胞胞質(zhì)內(nèi)尼氏體減少或淡染，少部分細胞中心尼氏體消失；針刺組部分神經(jīng)元細胞深染，少量神經(jīng)元細胞質(zhì)內(nèi)尼氏體輕度減少或淡染；對照組尼氏體基本正常(箭頭所示)。見圖1。

圖1 各組海馬HE及尼氏染色(×200)

3 討 論

海馬與紋狀體是兩個隊學(xué)習(xí)和記憶至關(guān)重要的大腦區(qū)域〔7〕。海馬對于學(xué)習(xí)形態(tài)和關(guān)聯(lián)性信息至關(guān)重要〔8,9〕。Markel等〔10〕研究結(jié)果表明，可遺傳的應(yīng)激誘導(dǎo)高血壓大鼠在應(yīng)激狀態(tài)時血壓急劇升高，下丘腦、垂體、腎上腺皮質(zhì)激活，海馬中糖皮質(zhì)激素受體基因表達下調(diào)。Pietranera等〔11〕研究表明，在SHR大鼠側(cè)腦室注射鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑會使SHR大鼠的血壓明顯下降。Novak等〔12〕研究則指出海馬等部位的萎縮與老年性高血壓存在著一定關(guān)系。

太沖〔13～15〕和太溪〔14〕穴是傳統(tǒng)針灸治療高血壓的常用穴位/穴組。臨床上常兩穴合用治療高血壓〔15,16〕。影像學(xué)方面研究，如功能性磁共振成像(fMRI)，對針刺兩穴降壓的研究不斷在進行〔17,18〕。Rs-fMRI研究降壓機制的文獻涵蓋了兩穴合用〔19,20〕、單用太沖〔21〕和單用太溪〔22〕的，但以上幾項研究對象為健康受試者。

本研究結(jié)果提示，針刺可有效預(yù)防SHR大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，并通過防止尼氏體減少，從而達到保護神經(jīng)元細胞的功能水平這一目的。

綜上所述，針刺太沖、太溪穴能夠有效減緩SHR血壓上升趨勢，對其學(xué)習(xí)記憶能力的改善有一定效果，并且經(jīng)過組織病理學(xué)證實了針刺對預(yù)防海馬神經(jīng)元凋亡起到了積極的作用。本研究的局限性在于樣本量相對較少，尚需多中心大樣本的隨機對照臨床試驗。