王茹 鐘桂蘭 王小花 林芳婷 吳清瑜

(海南省婦幼保健院(海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心)婦科，海南 ?？?570000)

卵巢癌盡管外科手術(shù)和放化療等治療手段使患者的生存時(shí)間有所延長(zhǎng)，但卵巢癌患者5年總生存率不超過(guò)30%〔1〕。卵巢上皮癌是卵巢癌最常見的病理類型，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，與多種基因的異常表達(dá)密切相關(guān)〔2～4〕。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)3在卵巢癌中異常低表達(dá)，且其表達(dá)改變與患者預(yù)后不良有關(guān)〔5〕；然而，SOCS3在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用并不清楚。本研究分析SOCS3在卵巢上皮癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE-80(貨號(hào)：MZ-2207)購(gòu)于寧波明舟生物公司；卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV-3(貨號(hào)：GD-C3220384)、OVCAR-3(貨號(hào)：FS-0329)和HO8910(貨號(hào)：XY-XB-1086)購(gòu)于美國(guó)ATCC。

1.2主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基(貨號(hào)：C22400500BT)、McCoy 5A培養(yǎng)基(貨號(hào)：16600-082)和0.25%胰蛋白酶(貨號(hào)：25200-056)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(貨號(hào)：F8245-100)購(gòu)于上海索萊寶生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑(貨號(hào)：M2128-1G)和二甲基亞砜(貨號(hào)：D8418-50ML)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；二奎啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：P0009)和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：C1062L)購(gòu)于上海碧云天公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：4366596)購(gòu)于杭州沃森生物公司；Trizol試劑(貨號(hào)：15596026)和脂質(zhì)體2000(Lipofectamine2000)(貨號(hào)：11668-027)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；SOCS3抗體(貨號(hào)：ab14939)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號(hào)：ab8245)和白細(xì)胞介素(IL)-6抗體(貨號(hào)：ab9324)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3抗體(貨號(hào)sc-8019)和磷酸化(p)-STAT3抗體(貨號(hào)：sc-8059)購(gòu)于美國(guó)Santa cruz biotechnology公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記IgG二抗(貨號(hào)：KN10097)購(gòu)于上海研卉生物科技有限公司；pcDNA3.1-SOCS3過(guò)表達(dá)載體及pcDNA3.1空載體由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建完成；Gel Doc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)和CFX96型熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) SKOV-3細(xì)胞采用含10%胎牛血清的McCoy 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，IOSE-80、OVCAR-3和HO8910細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞均在5%CO2、37℃和濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2 d換液1次，3 d傳代1次，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)SOCS3 mRNA表達(dá) 采用Trizol法提取IOSE-80、OVCAR-3、HO8910和SKOV-3細(xì)胞總RNA后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取2 μl cDNA為模板，與12.5 μl SYBR Premix Ex Taq、1 μl上游引物、1 μl下游引物和8.5 μl H2O2配制成總體積為25 μl的反應(yīng)體系，將其放置熒光定量PCR儀上后，按照設(shè)定的反應(yīng)程序(95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán))進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算IOSE-80、OVCAR-3、HO8910和SKOV-3細(xì)胞中SOCS3 mRNA表達(dá)。其中，由上海生工生物合成的PCR引物序列如下：SOCS3上游引物：5′-CCAAGAACCTACGCATCAA-3′，下游：5′-GGAGTCCAGGTGACCGTTG-3′；GAPDH上游引物：5′-GGTC TCCTCTGACTTCAACA-3′，下游：5′-AGCCAAATTCG TTGTCATAC-3′。

1.5細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(未處理)、空載體組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體)和SOCS3組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOCS3過(guò)表達(dá)載體)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)接種至6孔細(xì)胞板上，置于5%CO2、37℃和濕度飽和的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，參照Lipofectamine2000說(shuō)明書步驟將pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-SOCS3過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至SKOV-3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，采用qRT-PCR法和Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果。

1.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的SOCS3組、空載體組和正常培養(yǎng)的對(duì)照組SKOV-3細(xì)胞按照每孔105個(gè)接種至96孔細(xì)胞板上，其中每組設(shè)置3個(gè)平行孔，置于5%CO2、37℃和濕度飽和的環(huán)境下培養(yǎng)24、48、72和96 h后，棄培養(yǎng)液；每孔加入濃度為5 mg/ml MTT試劑20 μl；孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜；震蕩反應(yīng)15 min后，上酶標(biāo)儀在490 nm處檢查各組細(xì)胞的細(xì)胞光密度(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后SOCS3組、空載體組和正常培養(yǎng)對(duì)照組細(xì)胞，以磷酸緩沖液制成濃度為106個(gè)/ml細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液1 ml置于離心管中，以1 000 r/min在4℃下離心5 min后，棄上清液；加入200 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞后，依次加入各5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)和碘化丙啶(PI)，充分混勻后避光環(huán)境下反應(yīng)20 min。補(bǔ)加300 μl結(jié)合緩沖液后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8Western印跡檢測(cè)SOCS3、IL-6、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá) 向IOSE-80、OVCAR-3、HO8910或SKOV-3細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白后，參照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)蛋白的濃度與純度。將變性后的蛋白樣品按照每孔60 μg上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中，其中每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。行電泳分離后，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。以5%脫脂奶粉封閉60 min后，洗膜緩沖液洗膜5 min×3次。加入SOCS3(1∶500)、IL-6(1∶500)、STAT3(1∶200)、p-STAT3(1∶200)和GAPDH(1∶1 000)抗體4℃孵育過(guò)夜。洗膜后，加入相應(yīng)二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。再次洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光劑在暗室內(nèi)顯影曝光。采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SOCS3在卵巢上皮癌細(xì)胞中表達(dá)水平 與人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE-80相比，卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV-3、OVCAR-3和HO8910中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，其中SKOV-3細(xì)胞中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)最低。故后續(xù)以SKOV-3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見圖1和表1。

表1 各細(xì)胞系中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖1 Western印跡檢測(cè)各細(xì)胞系SOCS3蛋白表達(dá)

2.2轉(zhuǎn)染后卵巢上皮癌細(xì)胞中SOCS3表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，空載體組細(xì)胞中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而SOCS3組細(xì)胞中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組、空載體組均明顯升高(P<0.05)。見圖2和表2。

圖2 Western印跡檢測(cè)SOCS3蛋白表達(dá)

2.3SOCS3過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢上皮癌細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h后空載體組細(xì)胞增殖活力與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染48、72和96 h后SOCS3組細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組、空載體組均明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)染不同時(shí)間細(xì)胞增殖活力、IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)比較

2.4SOCS3過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢上皮癌細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組、空載體組和SOCS3組細(xì)胞凋亡率分別為(3.25±0.26)%，(3.78±0.30)%和(13.01±0.56)%，各組細(xì)胞凋亡率存在明顯差異(F=541.040，P<0.001)。與對(duì)照組比較，空載體組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但SOCS3組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組、空載體組明顯升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

2.5SOCS3過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢上皮癌細(xì)胞中IL-6/STAT3信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組比較，空載體組細(xì)胞中IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組、空載體組比較，SOCS3組細(xì)胞中IL-6和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見表2和圖4。

圖4 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)

3 討 論

卵巢癌具有發(fā)病隱匿和進(jìn)程快等特點(diǎn)，多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期，錯(cuò)失了手術(shù)治療的最佳時(shí)期，而以鉑類為主的化療效果并不理想〔6～8〕。隨著科技的不斷發(fā)展及精準(zhǔn)醫(yī)療的提出，分子靶向治療使卵巢癌患者的治療趨于個(gè)體化和精準(zhǔn)化〔9〕。因此，尋找新的、有效的治療靶點(diǎn)一直是近年來(lái)卵巢癌研究的熱點(diǎn)。

SOCS3是SOCS家族成員，定位于17q25.3染色體上，由675個(gè)氨基酸組成；該基因啟動(dòng)子上存在能夠與STAT3的結(jié)合位點(diǎn)，可負(fù)向調(diào)控STAT3介導(dǎo)的信號(hào)通路〔10〕。Li等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，SOCS3在肺癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，可被miR-410靶向調(diào)控，且在miR-410低表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著積極作用。洪洙等〔12〕報(bào)道指出，SOCS3在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)其表達(dá)可通過(guò)甲基化作用抑制SW480細(xì)胞增殖和侵襲，SOCS3被認(rèn)為是結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。馬張婧等〔13〕在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)可通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子STAT3的負(fù)反饋?zhàn)饔靡种瓢┘?xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，SOCS3過(guò)表達(dá)可抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示SOCS3可通過(guò)調(diào)控癌細(xì)胞增殖和凋亡在卵巢上皮癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的抑癌作用。

IL-6是一種可由多種細(xì)胞產(chǎn)生的多功能因子，它不僅可誘導(dǎo)一系列炎性因子的表達(dá)，還可通過(guò)激活STAT3通路參與細(xì)胞增殖和凋亡，與卵巢上皮癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，阻斷IL-6/STAT3通路可能是治療卵巢上皮癌的重要策略〔14～16〕。通常情況下，SOCS3在細(xì)胞中呈低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)；當(dāng)受到某些炎癥因子如IL-6刺激時(shí)，SOCS3表達(dá)水平明顯升高〔17〕；而SOCS3表達(dá)升高又可抑制IL-6介導(dǎo)的信號(hào)通路〔12〕。張婷等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)病理性疼痛小鼠模型中SOCS3過(guò)表達(dá)可抑制膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子IL-6的表達(dá)。Tu等〔19〕在五加侖葡萄糖抗狂犬病病毒實(shí)驗(yàn)中及黃玲玲等〔20〕在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病研究中證實(shí)SOCS3過(guò)表達(dá)可抑制STAT3通路的活化。本研究結(jié)果表明，SOCS3過(guò)表達(dá)可抑制卵巢上皮癌SKOV-3細(xì)胞中IL-6/STAT3通路的活化。提示，SOCS3可能通過(guò)介導(dǎo)IL-6/STAT3通路參與卵巢上皮癌細(xì)胞增殖和凋亡。