張麗 吳美延 許穎 許鐘鎬

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腎病科，吉林 長(zhǎng)春 130061)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎臟病常見(jiàn)原因之一〔1〕。糖尿病起始原因在于細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取功能紊亂，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取需要借助于細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)〔2〕。GLUT是一類調(diào)控細(xì)胞外葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的跨膜蛋白家族，GLUT已經(jīng)被鑒定出14種蛋白，并表現(xiàn)出廣泛的組織特異性調(diào)節(jié)分布，GLUT蛋白被認(rèn)為具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。在腎臟組織中，主要分布在血管平滑肌細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、腎小管髓袢升支粗段等部位〔3〕。在培養(yǎng)的腎小球膜細(xì)胞中，GLUT1似乎是主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但因?yàn)镚LUT4在培養(yǎng)中不斷下調(diào)，因此系膜細(xì)胞攝取葡萄糖主要依靠GLUT1〔4〕。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為GLUT表達(dá)增多，腎臟細(xì)胞內(nèi)蓄積多余葡萄糖而致系膜細(xì)胞肥大，細(xì)胞外基質(zhì)增多，最終導(dǎo)致蛋白尿，因此，GLUT表達(dá)及易位異常是DN發(fā)生的關(guān)鍵因素之一〔5〕。近年來(lái)來(lái)自花生四烯酸的12脂氧化酶(12-LO)通路及其活化產(chǎn)物12-氫氧化二十碳四烯酸(HETE)，已被證實(shí)通過(guò)p38絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路介導(dǎo)糖尿病腎小球肥大，參與DN的發(fā)生〔6〕。影響12-LO-12(S)-HETE 途徑可阻止腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，改善胰島素抵抗，從而延緩2型糖尿病腎小球肥大和蛋白尿的進(jìn)展〔7,8〕。有研究表明，在血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，GLUT1、12-LO及12-HETE的表達(dá)隨著細(xì)胞外葡萄糖濃度變化而變化，且具有類似的時(shí)間依賴性〔9〕。12-LO在DN腎組織中明顯升高，而GLUT1通過(guò)非依賴胰島素方式受葡萄糖濃度調(diào)節(jié)〔10〕，因此推測(cè)在糖尿病中GLUT1與12-LO之間可能存在密切聯(lián)系，GLUT1對(duì)DN的具體作用機(jī)制尚不明確，所以對(duì)糖尿病腎小球內(nèi)GLUT1的變化及GLUT1與12-LO之間相關(guān)關(guān)系的研究具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)造成2型糖尿病動(dòng)物模型及腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)研究在體內(nèi)及體外高糖(HG)對(duì)12-LO和GLUT1的作用。

1 材料和方法

1.1材料 大鼠腎小球系膜細(xì)胞系HBZY-1購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司，EMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，D-(+)-Glucose購(gòu)于德國(guó)Merck公司，STZ及 β-actin 抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，12-LO、GLUT1抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司，高脂飼料(含60%脂肪)購(gòu)于美國(guó)Research Diets公司，尿白蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、尿肌酐(UCr)ELISA試劑盒購(gòu)買于南京建成試劑公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)ABI公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、Anti-Rabbit IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)于美國(guó)millipore公司。

1.2腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇大鼠腎小球系膜細(xì)胞后用10% FBS EMEM培養(yǎng)至細(xì)胞融匯率達(dá)50%～60%，分成對(duì)照組和刺激組，對(duì)照組用1% FBS EMEM、刺激組用1% FBS EMEM+HG(30 mmol/L)，分別在12 h、24 h收集細(xì)胞后取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于RT-PCR。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)在12 h、24 h收集細(xì)胞后提取總蛋白，用于Western印跡檢測(cè)。

1.3動(dòng)物模型建立 建立高脂飲食結(jié)合小劑量STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型，于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司訂購(gòu)200～220 g雄性SD大鼠45只，隨機(jī)分成對(duì)照組(Control組，n=15)及高脂飲食組(DN組，n=30)，Control組給予正常飼料喂養(yǎng)，DN組給予高脂飼料6 w，根據(jù)體重采用STZ 35 mg/kg腹腔注射，以血糖>16.7 mmol/L為2型糖尿病造模成功標(biāo)準(zhǔn)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)成模并存活大鼠13只。實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠血糖、體重，收集24 h尿液。6 w后處死大鼠，提取大鼠腎臟，進(jìn)一步做相關(guān)指標(biāo)篩查及測(cè)定。

1.4尿蛋白肌酐比值(ACR)等生化指標(biāo)測(cè)定 ELISA試劑盒測(cè)定尿微量白蛋白(UALB)、尿肌酐(UCr)，ACR=UALB/UCr。取材前稱量大鼠重量(BW)，取大鼠右側(cè)腎臟鹽水沖洗后稱重(KW),計(jì)算腎臟肥大指數(shù)(KW/BW)，應(yīng)用相應(yīng)檢測(cè)試劑盒測(cè)定血糖(Glu)，三酰甘油(TG)，總膽固醇(TC)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.5Western印跡 大鼠腎組織裂解后提取蛋白，測(cè)蛋白濃度。將蛋白加樣于聚丙烯酰胺凝膠電泳(約1.5 h)，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜后分別加入12-LO(1∶1 000)、抗GLUT1(1∶5 000)、抗β-actin(1∶5 000)的第一抗體進(jìn)行雜交，4℃震蕩過(guò)夜，TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的第二抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h后顯影。

1.6RT-PCR Trizol法提取總RNA，RNA濃度及純度檢測(cè)，在0.2 ml的Ep管內(nèi)，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)液，合成cDNA。GAPDH正義引物5′-3′為GGAGAAACCTGCCAAGTATGA，反義5′-3′為TTGAAGTCACAGGAGACAACC；12-LO正義引物5′-3′為CTCCCTCCAAACATGAGATTCC，反義5′-3′為CCAGCTTCTCAGGAGGGTATAA；GLUT1正義引物5′-3′為CTCTGTGGGCCTCTTTGTTAAT；反義5′-3′為CCCAGTTTGGAGAAACCCATAA。

1.7病理學(xué)檢查

1.7.1過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色 石蠟切片法制備腎切片。將4 μm切片切至載玻片上，脫蠟、水合和用高碘酸氧化12 min。清洗后，用Schiff染料染色20 min，蘇木素反染色(1 min)，放入1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，蒸餾水清洗，氨水返藍(lán)5 s。通過(guò)光鏡以400倍放大率檢查每個(gè)切片中的腎小球。

1.7.2免疫組織化學(xué)染色(IHC) 對(duì)切片進(jìn)行脫蠟及水化，3%甲醇-H2O2溶液37℃孵育10～15 min，雙蒸水沖洗3 min。再進(jìn)行抗原熱修復(fù)，室溫下用正常羊血清封閉1 h。加用1%BSA抗體稀釋液稀釋的一抗12-LO抗體(1∶500)，于37℃孵育1～2 h。用PBS沖洗3次。HRP結(jié)合的第二抗體孵育1 min。蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。顯微鏡下400倍放大率觀察。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1.1高糖刺激下12-LO表達(dá)變化 與對(duì)照組相比，給予HG刺激12 h后，刺激組系膜細(xì)胞內(nèi)12-LO轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，刺激24 h后12-LO表達(dá)較12 h下降，但仍明顯高于對(duì)照組(見(jiàn)表1)。Western結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予HG刺激12 h、24 h后12-LO蛋白水平升高。見(jiàn)圖1。

2.1.2高糖刺激下GLUT1表達(dá)變化 與對(duì)照組相比，給予HG刺激12 h后，大鼠系膜細(xì)胞內(nèi)GLUT1轉(zhuǎn)錄水平升高，而24 h后GLUT1表達(dá)下降(見(jiàn)表1)。Western結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予HG刺激后刺激組GLUT1蛋白含量12 h升高，24 h降低。見(jiàn)圖1。

表1 兩組12-LO、GLUT1在體內(nèi)外轉(zhuǎn)錄水平

圖1 兩組腎小球系膜細(xì)胞中12-LO及GLUT1表達(dá)

2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.112-LO在糖尿病腎小球中的表達(dá)變化 與Control組相比，DN組腎組織內(nèi)12-LO轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(表2，P<0.05)，IHC顯示DN組腎小球內(nèi)12-LO表達(dá)增加(圖2)。

圖2 12-LO在兩組腎小球內(nèi)表達(dá)(IHC,×400)

2.2.2大鼠生化指標(biāo)比較 DN組ACR、KW/BW、Glu，TG、TC、LDL-C值均明顯高于Control組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組生化指標(biāo)比較

2.2.3兩組腎臟病理學(xué)檢查 Control組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管清晰，而DN組腎小球體積明顯增大，系膜基質(zhì)增生，囊腔裂隙變窄，腎小管管腔狹窄，腎小管腫脹(圖3)。

圖3 兩組腎臟組織PAS染色(×400)

2.2.4GLUT1在DN腎小球內(nèi)表達(dá)變化 與Control組相比，DN組腎小球內(nèi)GLUT1轉(zhuǎn)錄水平下降(表2,P<0.05)，IHC結(jié)果顯示DN組腎小球內(nèi)GLUT1表達(dá)減少(圖4)。

圖4 GLUT1在兩組腎小球內(nèi)表達(dá)(IHC,×400)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論在體內(nèi)還是體外12-LO表達(dá)均升高，而GLUT1在HG刺激早期表達(dá)升高，晚期下降。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型為高脂飲食6 w后糖尿病造模6 w的大鼠，未留取早期腎組織，未能觀察早期DN腎小球中12-LO及GLUT1的表達(dá)變化及相關(guān)關(guān)系，在下一步實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前，DN的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究證明高血糖會(huì)加速腎病進(jìn)展〔11〕，在腎小球系膜細(xì)胞中，GLUT1是調(diào)控葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的“看門人”，GLUT1的表達(dá)是葡萄糖利用的限速步驟〔12〕。目前已知的調(diào)節(jié)GLUT1基因表達(dá)的因素包括葡萄糖、血清生長(zhǎng)因子、缺氧和高滲透壓〔3〕。然而HG對(duì)GLUT1表達(dá)水平的調(diào)節(jié)尚未得到統(tǒng)一結(jié)論。有研究發(fā)現(xiàn)GLUT1表達(dá)增加提高細(xì)胞攝入葡萄糖，導(dǎo)致腎小球硬化的信號(hào)級(jí)聯(lián)激活〔11,13〕。即使血糖正常，過(guò)度表達(dá)GLUT1的轉(zhuǎn)基因小鼠仍會(huì)發(fā)生糖尿病性腎小球硬化〔13〕。相反，GLUT1反義序列的過(guò)度表達(dá)阻止了在高葡萄糖中培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞的糖尿病性改變〔14〕，而在糖尿病小鼠中，防止GLUT1表達(dá)升高會(huì)抑制系膜基質(zhì)的擴(kuò)張〔15〕。然而，其他一些研究卻得到相反的結(jié)論，在足細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)GLUT1的糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn)GLUT1表達(dá)對(duì)糖尿病系膜基質(zhì)擴(kuò)張有一定的改善作用〔16〕。此外，羅格列酮通過(guò)增加質(zhì)膜GLUT1的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)培養(yǎng)的足細(xì)胞的葡萄糖攝取,已知它可通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ依賴機(jī)制可降低腎小球血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平，減輕糖尿病腎小球病變，因此羅格列酮可能是通過(guò)其對(duì)GLUT1和VEGF的影響對(duì)DN產(chǎn)生保護(hù)作用〔17〕。 研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因敲除的1型糖尿病小鼠中腎組織GLUT1蛋白水平與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，而給予恩格列凈后GLUT1水平明顯升高〔18〕，提示恩格列凈可能通過(guò)提高GLUT1水平實(shí)現(xiàn)腎組織保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)GLUT1水平在HG狀態(tài)下先升高后降低。這與血管細(xì)胞中研究類似，Alpert等〔19〕發(fā)現(xiàn)HG環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)12-LO產(chǎn)物12-HETE水平升高，而GLUT1表達(dá)下降及質(zhì)膜豐度下降，從而限制細(xì)胞攝入過(guò)多葡萄糖及減少其破壞作用。因此，GLUT1表達(dá)的下降可能是應(yīng)對(duì)HG刺激下的保護(hù)性機(jī)制。

綜上，體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞內(nèi)12-LO表達(dá)升高，GLUT1表達(dá)在HG刺激早期升高而晚期下降。DN大鼠腎小球內(nèi)12-LO表達(dá)升高，GLUT1表達(dá)減少。DN條件下不同階段腎小球內(nèi)12-LO和GLUT1表達(dá)不完全同步提示12-LO和GLUT1在DN腎小球損傷過(guò)程中可能既有致病作用，又有保護(hù)性作用。