張靜 邢衛(wèi)斌 王琳

(天津市第五中心醫(yī)院皮膚科，天津 300450)

白癜風(fēng)是一種后天性色素脫失性疾病，遺傳背景的基礎(chǔ)上免疫因素發(fā)揮了重要作用。全基因組掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者有超過50個(gè)易感基因位點(diǎn)〔1～3〕，并且有家族史的白癜風(fēng)患者更容易發(fā)展為嚴(yán)重臨床類型〔4，5〕。中老年患者發(fā)病率相對(duì)較低，發(fā)病機(jī)制研究自然較少。本次研究利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)數(shù)據(jù)庫納入的中老年白癜風(fēng)患者數(shù)據(jù)信息，全面分析其皮損組織和自身正常皮膚組織基因表達(dá)譜差異，篩選可能的關(guān)鍵致病基因，旨在為進(jìn)一步闡明中老年患者白癜風(fēng)發(fā)病的遺傳學(xué)機(jī)制提供線索。

1 材料和方法

1.1數(shù)據(jù)來源 30例樣本均來自15例患者的皮損與自身正常皮膚組織，患者年齡均在40～65歲，病程1個(gè)月至3年?；虮磉_(dá)譜數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫，基于GPL6884平臺(tái)Illumina HumanWG-6 v3.0 expression beadchip芯片。

1.2差異表達(dá)基因篩選 根據(jù)GPL6884平臺(tái)探針的信息注釋相應(yīng)的基因，利用R(version4.0.1)的scale函數(shù)對(duì)基因的表達(dá)矩陣進(jìn)行歸一化處理，然后使用limma包分析差異表達(dá)基因，BH方法對(duì)統(tǒng)計(jì)P值進(jìn)行矯正，選取log2|Fold Change(FC)|>1.5及校正后PBH<0.05 作為差異表達(dá)基因的閾值。

1.3功能富集分析 利用toppgene在線工具對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析，PBH<0.05為閾值篩選顯著富集的京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)和反應(yīng)通路和生物學(xué)過程數(shù)據(jù)庫(Reactome)生物學(xué)通路。利用R包c(diǎn)luster Profiler(version3.8.1)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，PBH<0.05為閾值篩選顯著富集的生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)及分子功能(MF)。

1.4基因互作網(wǎng)絡(luò)分析 利用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因建立相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5所用到的數(shù)據(jù)庫 GEO(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)；toppgene(https：//toppgene.cchmc.org/)；KEGG(www.genome.jp/kegg)；Reactome(https：//reactome.org)；基因本體論(GO，http：//www.geneontology.org/)；STRING(https：//string-db.org/)。

2 結(jié) 果

2.1差異表達(dá)基因 白癜風(fēng)患者皮損組織與自身正常皮膚組織基因表達(dá)譜差異統(tǒng)計(jì)分析中篩選出了141個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中122個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，19個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。位于4號(hào)染色體上的趨化因子CXC配體(CXCL)10上調(diào)差異表達(dá)最為顯著，差異倍數(shù)log2FC=2.67，PBH<0.001。位于9號(hào)染色體上的酪氨酸相關(guān)蛋白(TYRP)1下調(diào)差異表達(dá)最為顯著，差異倍數(shù)log2FC=-2.40，PBH<0.001。由于篩選出的差異基因較少，因此利用R包OmicCircos對(duì)log2|FC|>1，P值<0.05的1 011個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行可視化見圖1。圖內(nèi)共有5個(gè)軌道，從外向內(nèi)，最外層軌道為染色體坐標(biāo)，第二層軌道為基因的表達(dá)熱圖，第三層軌道為基因表達(dá)的PBH散點(diǎn)圖，PBH值越小散點(diǎn)則越大，第四層軌道為基因表達(dá)的差異倍數(shù)(log2FC)的折線圖，最內(nèi)層軌道為差異表達(dá)基因的互作網(wǎng)絡(luò)圖。左側(cè)部分對(duì)我們篩選出的關(guān)鍵基因CXCL10和TYRP1的表達(dá)情況進(jìn)行突出顯示。

圖1 皮損組織與自身正常皮膚組織差異基因表達(dá)情況

2.2功能富集分析 利用PBH<0.05作為閾值篩選到了26條顯著富集的GO條目(13條BP條目和13條CC條目，未篩選出顯著的MF條目)。從結(jié)果可以看出大部分條目與基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程相關(guān)。見圖2。不同的散點(diǎn)形狀表示不同的GO類別，圓圈表示BP條目，三角形表示CC條目；散點(diǎn)的大小表示差異表達(dá)基因映射到該條目中基因的個(gè)數(shù)；顏色反映了富集的顯著性，顯著性越高，PBH值越小，顏色越紅；橫軸GeneRatio為映射到該條目的基因個(gè)數(shù)與該條目中基因總個(gè)數(shù)的比值。

圖2 差異表達(dá)基因顯著富集的GO BP、CC條目

2.3基因相互作用網(wǎng)絡(luò) 將141個(gè)差異表達(dá)基因映射到STRING數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中得到了

199條互作對(duì)(結(jié)果如圖1最內(nèi)層軌道所示)。其中對(duì)表達(dá)最為顯著的差異基因CXCL10和TYRP1網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)圖單獨(dú)顯示(黃色標(biāo)注，見圖3)，可以看出兩個(gè)基因通過多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)和CD69相互聯(lián)系，又分別和其他基因存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，并且CXCL10相對(duì)處于比較核心地位。

TYR：酪氨酸酶；SOX10: 性別決定區(qū)盒基因-10；POU3F1: POU結(jié)構(gòu)域第3類轉(zhuǎn)錄因子1；MLANA： 黑色素A；RGS1: 蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子1；LEO1：paf1/RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合物組分；IFIT1: 干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)蛋白1；IFI27：干擾素-α誘導(dǎo)蛋白27

2.4通路富集分析 利用PBH<0.05作為閾值篩選到了21條顯著富集的生物學(xué)通路(18條Reac-tome通路和3條KEGG通路，見表1)，從結(jié)果可以看出大部分通路與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯及氨基酸代謝相關(guān)。有部分基因參與了酪氨酸的代謝和黑素生成。

表1 差異表達(dá)基因顯著富集的生物學(xué)通路

3 討 論

白癜風(fēng)患者有明顯的家族遺傳背景，有人對(duì)150例白癜風(fēng)患者的家族發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，家族陽性史可占到26.0%，其中一級(jí)，二級(jí)，三級(jí)親屬共患率分別為14.6%，16.0%，4.7%，并表明遺傳因素在非節(jié)段型的白癜風(fēng)患者中具有更為明顯傾向〔6，7〕。而自身免疫學(xué)說在遺傳背景下發(fā)揮了重要的致病作用，文獻(xiàn)研究證實(shí)中老年白癜風(fēng)患者伴有自身免疫性甲狀腺疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的概率遠(yuǎn)高于一般人群，可能和細(xì)胞凋亡，免疫細(xì)胞異?；罨按罅靠贵w的產(chǎn)生有關(guān)〔8，9〕。本次研究發(fā)現(xiàn)CXCL10基因顯著上調(diào)表達(dá)，相關(guān)文獻(xiàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)〔10～12〕。CXCL10可由多種細(xì)胞分泌，如角質(zhì)形成細(xì)胞，中性粒細(xì)胞及樹突細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞本身在炎癥因子刺激下也可分泌CXCL10〔13～15〕。白癜風(fēng)皮損中存在大量促炎細(xì)胞及細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞被抗原刺激活化后分泌大量的干擾素(IFN)-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)多種細(xì)胞分泌趨化因子，使T細(xì)胞由外周向皮損組織定向遷移。這些抗原可能是皮損中的黑素細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞本身的抗氧化能力下降，易受活性氧(ROS)的損傷，細(xì)胞內(nèi)過多的ROS聚集導(dǎo)致黑素細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷。同時(shí)白癜風(fēng)患者角質(zhì)形成細(xì)胞也存在氧化應(yīng)激損傷，p38磷酸化等，不僅不能正常分泌維持黑素細(xì)胞生長(zhǎng)的一些營養(yǎng)源。同時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷也導(dǎo)致IFN-γ介導(dǎo)CXCL9/10-CXC趨化因子受體(CXCR)3軸異常激活，引起CXCL10在皮損中表達(dá)增加，血清亦是如此。CXCL10表達(dá)增加將進(jìn)一步募集更多的CD8+T細(xì)胞遷移皮損介導(dǎo)黑素細(xì)胞的破壞〔16，19〕。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過治療后的白癜風(fēng)患者血清和皮損組織的CXCL10表達(dá)水平明顯降低。所以趨化因子CXCL10不僅可以作為本病的一個(gè)治療靶點(diǎn)，同時(shí)也可以作為療效監(jiān)測(cè)指標(biāo)指導(dǎo)預(yù)后，甚至可以作為一個(gè)白癜風(fēng)診斷的血清學(xué)指標(biāo)，這些都有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。黑素為一組單體吲哚分子通過共價(jià)鍵連接，并于醌和蛋白質(zhì)高度聚合而形成的一種異質(zhì)性聚合物。在黑素形成過程中，TYR、TYRP1及TYRP2等構(gòu)成的酪氨酸相關(guān)蛋白(TRP)發(fā)揮著重要作用，同時(shí)這些蛋白也是黑素形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。這些蛋白和基因同時(shí)受到小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它們共同構(gòu)成立體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控黑素細(xì)胞的發(fā)育，分化和功能〔20〕。白癜風(fēng)是典型的黑素缺陷和(或)功能障礙性疾病，國內(nèi)學(xué)者曾對(duì)20例尋常型白癜風(fēng)患者皮損區(qū)域黑素細(xì)胞培養(yǎng)并進(jìn)行免疫印跡發(fā)現(xiàn)在患者皮損中，TYRP1，TYRP2及MITF均出現(xiàn)一致性的下調(diào)表達(dá)〔21〕，這一點(diǎn)和本次研究結(jié)果是完全吻合的。說明TYRP1的顯著下調(diào)，影響了黑素合成的質(zhì)和量，從而出現(xiàn)了色素脫失性皮損。MITF的表達(dá)水平本研究未涉及，有文獻(xiàn)表明在節(jié)段型的白癜風(fēng)患者，兩者表達(dá)水平并非一致，這些有待于后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，白癜風(fēng)是在遺傳基因表達(dá)異常情況下引起黑素合成受限，黑素細(xì)胞受到破壞的疾病。利用關(guān)鍵因子作為靶點(diǎn)制備新的生物制劑有望開辟一個(gè)新的治療前景。