陳錦英 李汶航 齊昊天 聶維辰 米佳 南征

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117;2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬眉山醫(yī)院；3北京中醫(yī)藥大學(xué)；4 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

糖尿病腎病(DKD)的主要臨床表現(xiàn)為血糖增高伴進(jìn)行性腎衰竭〔1〕，可導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)?，F(xiàn)代治療DKD常采用糾正高血糖、高血壓和血脂異常對(duì)癥治療及改變生活方式等方法延緩腎臟衰竭的進(jìn)程。中醫(yī)認(rèn)為，DKD屬于“消渴腎病”范疇，病理的關(guān)鍵在于肺、脾、腎功能失調(diào)〔2〕。中醫(yī)藥目前已廣泛應(yīng)用于腎病及其并發(fā)癥的治療，可改善腎功能、有效延緩腎衰竭進(jìn)程，以“邪伏膜原，毒損腎絡(luò)”為病機(jī)關(guān)鍵，創(chuàng)立消渴腎安湯〔3〕,通過導(dǎo)邪解毒益腎通絡(luò)之法治療DKD，在臨床治療中療效確切。但目前對(duì)相應(yīng)中藥配方組合的研究尚缺少對(duì)應(yīng)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，需要一項(xiàng)相對(duì)統(tǒng)一的研究方法對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行研判，因此采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將疾病和藥物整合到生物分子網(wǎng)絡(luò)中，預(yù)測(cè)活性成分和作用機(jī)制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對(duì)接技術(shù)探索消渴腎安湯治療DKD的潛在作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1消渴腎安湯生物活性成分和靶點(diǎn)篩選 藥物成分及靶點(diǎn)篩選：在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索消渴腎安湯組成藥物大黃、土茯苓、黃芪、黃精、覆盆子、金蕎麥、木蝴蝶、丹參、檳榔、草果、厚樸的活性成分，設(shè)定口服生物利用度(OB)≥30%、類藥指數(shù)(DL)≥0.18，對(duì)活性成分進(jìn)行篩選，若無法獲得相關(guān)靶點(diǎn)信息則將有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)相關(guān)性成分潛在靶點(diǎn)：從Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)有效成分的結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)格式(SDF)結(jié)構(gòu)，隨后將所得的結(jié)構(gòu)通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，取其中評(píng)分0.1的靶標(biāo)作為潛在靶點(diǎn)。將所得的藥物成分和相關(guān)靶點(diǎn)以Cytoscape8.9.2構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，選取其中Network Analyzer模塊對(duì)本方的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.2DKD靶點(diǎn)篩選 以“DKD”為關(guān)鍵詞，檢索OMIM、Disgenet、Genecards等數(shù)據(jù)庫，將取得的靶點(diǎn)進(jìn)行合并、去重，得到疾病作用靶點(diǎn)。

1.3消渴腎安湯活性成分與DKD共同靶點(diǎn)的篩選 利用微生信(網(wǎng)址：http：//www.bioinformatics.com.cn/)將二者靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖。

1.4蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò) 利用Metascape平臺(tái)(https://metascape.org/)對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得Metascape Gene List Analysis Report。將獲得的PPI導(dǎo)入Cystoscap8.9.2中工具進(jìn)行優(yōu)化處理。以“homo sapiens”模塊對(duì)導(dǎo)入的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，通過Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以度值、介值、平均最短路徑和緊密度這四個(gè)參數(shù)進(jìn)行參考，將其中分值排序前10的基因作為核心靶點(diǎn)。

1.5基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 以R軟件的Bioconductor包對(duì)相關(guān)基因作GO與KEGG富集分析，選取其中P<0.05的通路進(jìn)行注釋，以條形圖和氣泡圖形式輸出所獲得的通路和生物學(xué)功能。

1.6分子對(duì)接 使用Schr?dinger Maestro軟件對(duì)相關(guān)成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，以Protein Preparation Wizard模塊預(yù)處理相關(guān)受體并進(jìn)行優(yōu)化，利用OPLS3e力場(chǎng)進(jìn)行約束最小化， LigPrep模塊的默認(rèn)設(shè)置制備相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)。以Glide模塊導(dǎo)入制備好的受體，預(yù)測(cè)相應(yīng)的對(duì)接位點(diǎn)。以標(biāo)準(zhǔn)對(duì)接(SP)方法對(duì)分子進(jìn)行對(duì)接并完成篩選。根據(jù)其中化合物與蛋白間的作用情況預(yù)測(cè)化合物與蛋白殘基作用的特點(diǎn)，參考化合物的對(duì)接分值，推測(cè)擬篩的化合物活性特點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1消渴腎安湯潛在生物活性化合物和靶點(diǎn) 共得到主要活性成分149個(gè)，主要活性成分分析見圖1。

圖1 消渴腎安湯有效成分

2.2DKD靶點(diǎn)篩選 以“DKD”為關(guān)鍵詞分別在OMIM、Disgenet、Genecards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將獲得到的疾病靶點(diǎn)合并去重后，按照Score≥中位數(shù)值的目標(biāo)靶點(diǎn)為界值，篩選到1 372個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.3藥物活性成分-疾病共同靶點(diǎn)篩選 將篩選的消渴腎安湯活性成分靶點(diǎn)與DKD靶點(diǎn)取交集，并通過微生信軟件繪制韋恩圖(VEEN)，得到消渴腎安湯與DKD共同靶點(diǎn)76個(gè)。顏色隨著Degree值增加而加深，表明該成分越重要，其中活性最強(qiáng)的成分為C13：Baicalin(黃芩苷)，見圖2。

紅色：活性成分靶點(diǎn)，綠色：消渴腎安湯活性成分

2.4PPI構(gòu)建 將76個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)，并通過分?jǐn)?shù)進(jìn)行排序得到相關(guān)靶點(diǎn)基因NR3C1、RELA、FOS、PCNA、ESR1、MDM2、CCND1、IL6、MTOR、IKBKB。

2.5MCODE模塊注釋 將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI導(dǎo)入Cystoscap8.9.2中，使用MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析及核心靶點(diǎn)的篩選?？偣驳玫?個(gè)基因簇和5個(gè)核心基因(PRKCA、EGFR、ESR1、CYP2C9、ERBB2)。見圖3。

圖3 PPI與MCODE模塊注釋

2.6GO富集分析和KEGG通路分析

2.6.1GO分析 分別通過GO分析選取生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3部分對(duì)41個(gè)共通基因進(jìn)行注釋分析。結(jié)果顯示，交集基因集合共涉及3 299條生物學(xué)過程，主要為對(duì)類固醇激素的反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)、對(duì)酮的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)和對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等方面；交集基因集合共涉及237條細(xì)胞組分表達(dá)過程；主要為血漿脂蛋白顆粒、脂蛋白顆粒、蛋白脂復(fù)合物、基質(zhì)膜和膜筏等組分；交集基因集主要參與377個(gè)與分子功能相關(guān)的過程，主要有核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇結(jié)合、DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合等相關(guān)功能。見圖4。

AGE-RAGE:晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體

2.6.2KEGG分析 76個(gè)共同靶點(diǎn)共富集得到106條KEGG通路，前10的關(guān)鍵通路見圖5，富集到通路的靶點(diǎn)根據(jù)degree值排序，得到RAF1、BCL-2兩個(gè)最重要的靶點(diǎn)。

圖5 KEGG 通路富集

2.7分子對(duì)接驗(yàn)證 RAF1、BCL-2與黃芩苷結(jié)合能分別為-8.148、-7.265 kCal/mol。另外蛋白與小分子的復(fù)合物采用Pymol2.1進(jìn)行可視化分析，見圖6。黃芩苷化合物與靶點(diǎn)蛋白存在很好地結(jié)合作用且匹配度高，結(jié)合能均小于-5 kCal/mol。將對(duì)接后化合物與蛋白形成的復(fù)合物利用Pymol2.1軟件進(jìn)行可視化，得到化合物與蛋白的結(jié)合模式，根據(jù)結(jié)合模式可以很清晰看到化合物與蛋白口袋相結(jié)合的氨基酸殘基。

圖6 黃芩苷與RAF1、BCL-2分子對(duì)接驗(yàn)證

3 討 論

失調(diào)的內(nèi)分泌代謝環(huán)境是導(dǎo)致DKD的重要原因之一，臨床研究表明高血糖在 DKD 起始中起關(guān)鍵作用，但其在控制進(jìn)展的具體意義仍不明確。有可追溯的研究發(fā)現(xiàn)許多2型糖尿病(T2DM)患者在被診斷患有糖尿病之前可能已經(jīng)經(jīng)歷了多年的代謝改變〔4,5〕，所以導(dǎo)致他們被診斷為 T2DM 之前就已患上DKD〔6〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)約有200 000例DKD患者接受ESRD護(hù)理，且接受透析的人數(shù)以每年約5 000的數(shù)目遞增。即便如此，接受RSRD護(hù)理的DKD患者仍面臨約20%的年死亡率，這遠(yuǎn)超許多實(shí)體癌(包括前列腺癌、乳腺癌甚至腎細(xì)胞癌)的死亡率〔7〕。對(duì)于DKD患者，缺乏特異性西醫(yī)治療，最直接有效的治療方法是控糖、抑制腎病進(jìn)展。中藥方劑具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，由于其復(fù)雜的特性，導(dǎo)致僅靠普通的研究方法很難解釋其藥理機(jī)制。本研究推測(cè)黃芩苷可能是消渴腎安湯中發(fā)揮關(guān)鍵作用的潛在活性成分。事實(shí)上，黃芩苷具有抗炎〔8〕、抑癌癥〔9〕、保肝作用〔10〕，具有很強(qiáng)的抗氧化作用〔11〕。

Raf 包括A-Raf、B-Raf、C-Raf(即RAF1)，是GTP結(jié)合蛋白R(shí)as所募集的主要效應(yīng)因子，能激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MEK-MAP)激酶通路〔12〕。A-Raf、B-Raf、c-Raf 的序列和功能相似，但是調(diào)節(jié)方式各不相同〔13〕，c-Raf的活化涉及多個(gè)激活位點(diǎn)(包括 Ser338、Tyr341、Thr491、Ser494、Ser497 和 Ser499)的磷酸化。c-Raf 上的抑制性 14-3-3 結(jié)合位點(diǎn) Ser259 和 Ser621 可以分別由 Akt 和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來磷酸化〔14,15〕，而c-Raf 蛋白的失活特性與Ser29、Ser43、Ser289、Ser296、 Ser301 和 Ser642 位點(diǎn)的過度磷酸化相關(guān)，并依賴于下游的 MEK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致 c-Raf 對(duì)后續(xù)的激活事件無反應(yīng)〔16〕。在各種凋亡刺激因子作用下，BCL-2可通過抑制線粒體細(xì)胞色素c的釋放而發(fā)揮存活功能〔17〕，它與線粒體鈣穩(wěn)態(tài)和質(zhì)子流的調(diào)節(jié)有關(guān)〔18〕?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)BCL-2的Thr56、Ser70、Thr74 和 Ser87等磷酸化位點(diǎn)〔19〕。經(jīng)證實(shí)，這些磷酸化位點(diǎn)可能是凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ASK)1/絲裂原活化蛋白激酶(MKK)7/應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)1通路的靶標(biāo)〔20〕，并且BCL-2 的磷酸化可能是有絲分裂活動(dòng)的一個(gè)標(biāo)志〔21〕。白細(xì)胞介素3和JNK誘導(dǎo)的 BCL-2 在 Ser70 位點(diǎn)磷酸化，可能對(duì)增強(qiáng)抗凋亡作用至關(guān)重要〔22〕。DKD患者體內(nèi)的高糖環(huán)境，使腎臟細(xì)胞的氧化代謝活動(dòng)受到影響，在缺氧和炎癥刺激的雙重作用下，腎臟細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死，因此DKD患者的治療目標(biāo)是保護(hù)腎臟，改善體內(nèi)高糖環(huán)境。研究表明，脂肪酸氧化向糖酵解的轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生類似于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡逃逸的作用，提高細(xì)胞在缺氧條件下的存活率〔23,24〕。本文證實(shí)了消渴腎安湯的潛在作用機(jī)制是基于多個(gè)靶點(diǎn)和多個(gè)信號(hào)通路的協(xié)同作用。富集途徑主要涉及類固醇激素反應(yīng)、對(duì)酮反應(yīng)、細(xì)胞化學(xué)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、皮質(zhì)類固醇反應(yīng)、輻射反應(yīng)調(diào)節(jié)等方面。線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激和酮代謝密切相關(guān)〔25～27〕。研究表明，DKD患者存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的線粒體功能障礙〔28〕，有類似研究發(fā)現(xiàn)，木蝴蝶莖皮的主要提取物(黃芩苷和白楊素)可通過升高蛋白激酶(PK)C，降低核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB及AGEs/RAGE，改善細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)〔29〕。由此可以推測(cè)，消渴腎安湯治療DKD的主要機(jī)制可能是下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，對(duì)抗氧化應(yīng)激，從而抑制腎臟內(nèi)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)、抑制細(xì)胞凋亡。更重要的是，保護(hù)線粒體可能是消渴腎安湯治療DKD的潛在機(jī)制。

綜上，黃芩苷可能通過作用于RAF1、BCL-2這兩個(gè)靶標(biāo)影響后續(xù)生物學(xué)通路的激活，從而調(diào)節(jié)DKD的進(jìn)展。