董霄 吳多智 曹芹芳 孔燦燦 高照

(海南省人民醫(yī)院(海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院) 1老年醫(yī)學(xué)中心，海南 ?？?570311;2消化內(nèi)科;3內(nèi)鏡中心)

世界上超過半數(shù)的人口均發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(Hp)在胃上皮定植，亞洲、中美洲和南美洲是流行率最高的地區(qū)〔1〕。Hp一旦傳播到胃，通過脲酶中和胃酸、鞭毛鞘保護(hù)鞭毛抵御胃酸侵襲，順利移動至胃上皮細(xì)胞，在胃黏膜形成永久性感染，誘發(fā)免疫反應(yīng)，若不及時治療，會導(dǎo)致慢性胃炎、腸上皮化生、異型增生的逐漸發(fā)展，最終導(dǎo)致胃癌，而早期預(yù)防Hp定植可以降低胃癌發(fā)病率〔2〕。Hp致病性和其誘發(fā)疾病的潛在進(jìn)展與其攜帶的毒力基因相關(guān)，如cagA與胃黏膜炎癥及更嚴(yán)重的Hp感染臨床后果相關(guān)〔3〕，vacA編碼的細(xì)胞毒素通過形成空泡對上皮細(xì)胞造成損傷，從而啟動促炎反應(yīng)，特異性抑制T細(xì)胞激活和增殖〔4〕。以上兩種是嚴(yán)重Hp感染相關(guān)的毒力基因，但不足以解釋Hp感染相關(guān)胃病的臨床病理多樣性。因此，需要明確是否存在其他Hp毒力基因與臨床病理傾向相關(guān)。目前尚無Hp感染胃腺癌病原體基因表達(dá)的相關(guān)研究，本研究擬對比分析老年慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃腺癌患者胃鏡活檢樣本Hp毒力基因的差異表達(dá)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取海南省人民醫(yī)院2019年1月至2020年1月收治的老年慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃腺癌患者胃活檢樣本各40份。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥60周歲；(2)慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎經(jīng)胃鏡檢查確診〔5〕，胃癌患者經(jīng)胃鏡、病理學(xué)檢查等確定為腺癌〔6〕；(3)經(jīng)13C呼氣試驗(yàn)證實(shí)存在Hp感染；(4)未經(jīng)Hp根除治療；(5)患者及家屬對本研究知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有胃部手術(shù)史或放、化療史；(2)嚴(yán)重心、肺疾病者；(3)胃鏡前1 w內(nèi)曾服用抗凝藥物；(4)患有精神疾病、依從性差；(5)臨床資料不完整。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合赫爾辛人體試驗(yàn)準(zhǔn)則。3組性別、年齡、基礎(chǔ)疾病差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組一般情況比較

1.2Hp分離與培養(yǎng) 胃鏡前1 d囑咐患者保持空腹6～8 h，在患者接受檢查前完善血壓、心電圖檢查，確定無異常方可進(jìn)行。參考《消化內(nèi)鏡金標(biāo)準(zhǔn)與操作手冊》〔7〕進(jìn)行胃鏡檢查，取部分胃竇或胃體的胃黏膜組織，一部分送至檢驗(yàn)科進(jìn)行病理學(xué)檢測，一部分置于無菌生理鹽水中保存用于基因檢測。快速尿素酶試驗(yàn)鑒定Hp菌株后，常規(guī)培養(yǎng)7 d并進(jìn)行革蘭染色。

1.3PCR檢測毒力基因 試劑盒提取Hp菌株DNA，按照試劑盒配制PCR體系，采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，條件：95℃，5 min預(yù)變性；95℃，30 s，50℃，30 s，72℃，30 s，循環(huán)30次；72℃，7 min延伸。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，條帶送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測序，毒力基因引物序列見表2。

表2 Hp毒力基因引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)、單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)、Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.13組Hp毒力基因分布 Hp cagA、vacA s1、vacA m1、vacA m2、dupA、iceA1、oipA基因在3組胃黏膜樣本中均有檢出，3組vacA s1檢出率均為100.00%，cagA、vacA m2、iceA1和oipA檢出率均高于50.00%，vacA s2均未檢出，vacA m1與vacA m2為互補(bǔ)關(guān)系(P<0.05)；3組Hp cagA、iceA1、iceA2、iceA1+iceA2、oipA基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中cagA、iceA1在胃腺癌組顯著高表達(dá)(P<0.05)，iceA2、iceA1+iceA2、oipA在慢性非萎縮性胃炎組和慢性萎縮性胃炎組中顯著高表達(dá)(P<0.05)，見表3。

表3 3組Hp毒力基因分布〔n(%),n=40〕

2.2Hp毒力基因與疾病相關(guān)性 Logistic回歸分析顯示，比較慢性萎縮性胃炎、胃腺癌發(fā)生時，cagA、iceA1與胃腺癌相關(guān)(P<0.05)，iceA2、iceA1+iceA2、oipA與慢性萎縮性胃炎相關(guān)(P<0.05)；比較慢性非萎縮性胃炎、胃腺癌發(fā)生時，iceA1與胃腺癌相關(guān)(P<0.05)，iceA2、iceA1+iceA2、oipA與慢性非萎縮性胃炎相關(guān)(P<0.05)；比較慢性萎縮性胃炎、慢性非萎縮性胃炎發(fā)生時，iceA1+iceA2與慢性非萎縮性胃炎相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 Hp毒力基因與Hp相關(guān)性胃病的相關(guān)性

3 討 論

Hp是一種革蘭陰性菌，在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)高感染率，但大部分感染者沒有明顯癥狀，僅在胃鏡下才能檢出胃炎，Hp感染的結(jié)果主要取決于其與胃、外部環(huán)境之間的相互作用〔8〕。Hp會產(chǎn)生許多因素和策略來適應(yīng)胃酸環(huán)境，并建立持續(xù)感染，可中和胃酸環(huán)境的脲酶、鞭毛、螺旋形狀等因素相結(jié)合，形成有效的趨化系統(tǒng)以幫助Hp到達(dá)胃黏膜的保護(hù)性黏液層〔9〕。目前治療Hp最常用的療法是基于克拉霉素的三聯(lián)療法或用新型抗生素替代克拉霉素的四聯(lián)療法〔10〕，抗生素的過度使用也使Hp對克拉霉素產(chǎn)生耐藥性，研究發(fā)現(xiàn)23S rRNA基因的A2143G突變與Hp對克拉霉素耐藥相關(guān)〔11〕，表明Hp基因突變與產(chǎn)生耐藥性相關(guān)。除此之外，Hp臨床分離株檢測到的毒力基因也參與了疾病癥狀的發(fā)展，并宿主基因多態(tài)性、環(huán)境因素共同確定誘導(dǎo)疾病類型〔12〕。

本研究中120株Hp菌株中，除vacA s2外，其余8種毒力基因均有檢出，且vacA s1的檢出率為100.00%，不同疾病來源Hp中vacA m1、vacA m2均互補(bǔ)關(guān)系，與過去的研究結(jié)果一致〔13〕，本研究結(jié)果表明海口地區(qū)老年Hp相關(guān)性胃病病原菌流行的毒力基因以vacA m1、cagA、vacA m2、iceA1和oipA為主，還發(fā)現(xiàn)cagA、iceA1、iceA2、iceA1+iceA2、oipA是主要的差異毒力基因。CagA和vacA均參與腫瘤免疫逃逸和誘導(dǎo)疾病，cagA是一個125～145 kD的效應(yīng)蛋白，該蛋白的Hp菌株被認(rèn)為具有高毒力，cagA合成后通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到胃上皮細(xì)胞，其EPIYA基序的酪氨酸殘基會被多種細(xì)胞激酶磷酸化，導(dǎo)致多種細(xì)胞信號通路失調(diào)，其中包括Wnt、ERK信號通路，后者已被發(fā)現(xiàn)在胃癌等多種惡性腫瘤的侵襲和發(fā)展中起重要作用〔14,15〕。vacA是一種外毒素，能在真核細(xì)胞中引起空泡化，還有研究表明vacA介導(dǎo)促使cagA蛋白降解的自噬途徑破壞，增強(qiáng)Hp毒性〔16〕，所有Hp菌株中有vacA表達(dá)，但只有約50%的菌株具有空泡形成活性，這是由于其信號區(qū)s、中間區(qū)m的基因多態(tài)性〔17〕，s1型表現(xiàn)出疏水特性，介導(dǎo)毒素的二聚化，促進(jìn)陰離子選擇性通道形成，s2型具有12個氨基酸的親水序列延伸，提供與s1不同的裂解位點(diǎn)，從而抑制細(xì)胞空泡化，m1和m2的差異導(dǎo)致Hp毒力不同及胃炎、胃癌的離散發(fā)病率〔18〕。iceA在Hp與胃上皮接觸后誘導(dǎo)，分為iceA1和iceA2兩個等位基因變體，iceA1是東亞地區(qū)主要流行的亞型，與消化性潰瘍和胃黏膜白細(xì)胞介素(IL)-8水平升高有關(guān)，而iceA2主要在美洲流行〔19〕。dupA具有多功能生物活性，被認(rèn)為是十二指腸潰瘍的重要生物標(biāo)志物〔20〕。oipA是Hp的一種黏附素，可誘導(dǎo)炎癥并產(chǎn)生IL-8，也有研究表明其與cagA在發(fā)病機(jī)制上具有協(xié)同作用，Teymournejad等〔21〕發(fā)現(xiàn)oipA通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2水平誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞凋亡。

本研究慢性萎縮性胃炎、慢性非萎縮性胃炎的Hp毒力基因差異表達(dá)結(jié)果與劉麗娜等〔22〕研究相一致。本研究首次分析了不同Hp相關(guān)性胃病的Hp毒力基因表達(dá)差異，不足之處在于樣本量較小，且未深入探究出現(xiàn)此差異的機(jī)制，應(yīng)擴(kuò)大樣本量以增加結(jié)果的準(zhǔn)確性，并開展進(jìn)一步機(jī)制研究。

綜上，?？诘貐^(qū)老年Hp相關(guān)性胃病病原菌流行的毒力基因以vacA m1、cagA、vacA m2、iceA1和oipA為主，慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃腺癌患者臨床分離Hp菌株的毒力基因表達(dá)具有差異，cagA、iceA1與胃腺癌相關(guān)，iceA2、iceA1+iceA2、oipA與慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎相關(guān)，而iceA1+iceA2又與慢性非萎縮性胃炎相關(guān)。