曹振華 王蕾 魏永潔

(青海省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，青海 西寧 810000)

我國慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病率在不同年齡段差異較大，20～40歲人群中約8.6%，40 歲以上人群約13.7%，患者總體數(shù)量達(dá)1億多〔1〕。COPD發(fā)病率和死亡率不斷上升，在全世界死因中排名中已躍升至第四位〔2〕。老年性群體為COPD高發(fā)群體，且多數(shù)合并心血管基礎(chǔ)疾病，加之近幾年抗菌藥和激素的不合理使用，COPD患者尤其是老年患者感染真菌的病例數(shù)顯著增加〔3〕。COPD患者一旦發(fā)生真菌感染，病情復(fù)雜多變，臨床治療更為棘手，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。近幾年，輔助性T細(xì)胞(Th)17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在真菌感染中的作用受到眾多學(xué)者關(guān)注，有研究顯示〔4〕，Th17型免疫反應(yīng)及Treg在真菌的清除機(jī)制和抑制真菌感染引起的炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，真菌感染后Th17/Treg比值出現(xiàn)下調(diào)。也有多數(shù)研究證實(shí)〔5,6〕，COPD患者氣道高反應(yīng)與Th17/Treg比值失衡存在密切關(guān)系，在COPD患者中Th17/Treg比值出現(xiàn)上調(diào)。由上述研究可知，老年COPD患者Th17/Treg比值已處于高水平，繼發(fā)真菌感染后，Th17/Treg變化情況及Th17/Treg細(xì)胞失衡對真菌侵襲老年COPD患者的影響尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討老年COPD患者Th17/Treg失衡對繼發(fā)真菌感染的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2019年1月至2021年12月青海省人民醫(yī)院收治的老年COPD患者117例為研究組，根據(jù)病原學(xué)檢查結(jié)果，并參照《感染性疾病診療指南》中關(guān)于真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為繼發(fā)真菌感染COPD組(n=31)和單純COPD組(n=86)兩個(gè)亞組，另選擇同期來醫(yī)院體檢健康者90例為對照組。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷為COPD，參照《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》〔7〕中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均行肺功能檢查，存在不完全可逆的氣流受限〔1 s用力呼氣容積(FEV1)<80%預(yù)計(jì)值，且FEV1/用力肺活量(FVC)<70%〕；②入院后繼發(fā)真菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者出現(xiàn)真菌感染相關(guān)臨床表現(xiàn)，以同一檢驗(yàn)標(biāo)本中(包括血液、尿液、痰、皮屑等)連續(xù)2次在電鏡下檢出真菌孢子和真菌菌絲，或標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)出同一真菌為準(zhǔn)，并參照《感染性疾病診療指南》〔8〕中關(guān)于真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③年齡≥65歲。研究組排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前已存在嚴(yán)重感染；②合并肺部其他嚴(yán)重疾病者，如肺癌、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等；③合并其他臟器如心、肝、腦、腎等功能嚴(yán)重異常者。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①常規(guī)體檢無明顯異常者，均行肺功能檢查無氣流受限；②年齡≥65歲。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：存在急慢性感染性疾病者。3組基線資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

表1 3組基線資料比較

1.2檢測方法 Th17、Treg水平測定：采用肝素抗凝管采集受試者空腹外周靜脈血8 ml，送至檢驗(yàn)科分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)備檢。(1)Th17水平測定。①取樣：取一定密度(1×106)的單個(gè)核細(xì)胞，加入佛波醇乙酯(劑量5 μg/L)和離子霉素(劑量1 mg/L)置于37℃保溫箱中，經(jīng)5 h孵育后采用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行2次沖洗；②染色：在避光環(huán)境下進(jìn)行染色處理(溫度控制在4℃)，染色劑為CD3-Percp和CD4-APC，加入數(shù)量均為20 μg，染色30 min后再次采用PBS進(jìn)行2次沖洗；③固定：對沖洗后的標(biāo)本進(jìn)行固定，固定液為Fix/Premmedium A，固定時(shí)間為15 min；④破膜染色，染色劑為Fix/Prem medium B液和FITC-IL-17A，避光置于室溫下，25 min后采用PBS進(jìn)行2次沖洗；⑤儀器測定：采用BECKMANCoULTER流式細(xì)胞儀(型號：CytoFLEX)檢測Th17水平。(2)Treg水平測定。①取樣：取樣方法同上；②染色：在避光環(huán)境下進(jìn)行染色處理(溫度控制在4℃)，染色劑為CD3-Percp、CD4-APC及CD25-PE，加入數(shù)量均為20 μg，染色30 min后再次采用PBS進(jìn)行2次沖洗；③固定：對沖洗后的標(biāo)本進(jìn)行固定，固定液為Foxp3/固定破膜工作液，固定時(shí)間為30 min；④離心，固定時(shí)間結(jié)束后，對標(biāo)本進(jìn)行離心處理(800 r/min離心5 min)，去除上清后采用Foxp3破膜緩沖液進(jìn)行1次沖洗；⑤破膜染色，染色劑為FITC-Foxp3抗體，避光置于4℃環(huán)境下，30 min后采用PBS進(jìn)行2次沖洗，并采用PBS重懸細(xì)胞；⑥儀器測定：采用BECKMANCoULTER流式細(xì)胞儀(型號：CytoFLEX)檢測Treg水平。(3)根據(jù)Th17、Treg測定值計(jì)算Th17/Treg比值。比較研究組與對照組及研究組兩個(gè)亞組Th17/Treg差異，分析其對老年COPD患者繼發(fā)真菌感染的影響。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析、Logistic回歸分析及線性回歸檢驗(yàn)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血Th17、Treg、Th17/Treg水平比較 相比對照組，研究組Th17水平更高，Treg水平更低，Th17/Treg比值顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

表2 兩組外周血Th17、Treg、Th17/Treg水平比較

2.2繼發(fā)真菌感染COPD組與單純COPD組不同臨床病理因素比較 兩組激素使用劑量、激素使用時(shí)長、抗菌藥使用時(shí)長、血漿白蛋白、住院時(shí)長及外周血(Th17、Treg、Th17/Treg)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.001)，見表3。

表3 繼發(fā)真菌感染COPD組與單純COPD組不同臨床病理因素比較

2.3老年COPD患者繼發(fā)真菌感染臨床病理因素的 Logistic 回歸分析 Logistic回歸分析(因變量：老年COPD患者是否繼發(fā)真菌感染，自變量：各種臨床病理因素)結(jié)果顯示，大劑量激素使用、長期激素和抗菌藥使用、長期住院、Th17/Treg比值下調(diào)是老年COPD患者繼發(fā)真菌感染的高風(fēng)險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表4 老年COPD患者繼發(fā)真菌感染臨床病理因素的 Logistic 回歸分析

2.4Th17/Treg水平與老年COPD患者感染真菌的相關(guān)強(qiáng)度分析 線性回歸分析顯示，Th17/Treg細(xì)胞失衡對真菌侵襲老年COPD患者有重要影響(P<0.001)，得到線性回歸方程:Y=-1.418-0.737X，見表5。

表5 Th17/Treg水平與老年COPD患者感染真菌的相關(guān)強(qiáng)度分析

3 討 論

COPD患者主要表現(xiàn)為呼氣過程中氣流明顯受限，且氣流受限不能完全緩解，隨著時(shí)間呈進(jìn)行性發(fā)展〔9〕。有國外文獻(xiàn)指出〔10〕，存在肺部基礎(chǔ)疾病患者是繼發(fā)肺部侵襲性真菌感染的高風(fēng)險(xiǎn)人群，尤其是COPD患者，繼發(fā)肺部真菌感染發(fā)生率可高達(dá)44%以上。國內(nèi)COPD患者繼發(fā)肺真菌感染發(fā)生率目前尚無統(tǒng)一結(jié)論，就目前一些樣本資料統(tǒng)計(jì)發(fā)生率在11%～44%，本研究為26.50%，在上述范圍內(nèi)。肺部真菌感染會(huì)加速病情惡化，增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，盡早接受足療程、足量抗真菌治療，對降低死亡率至關(guān)重要〔11〕。肺部真菌感染的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查無典型特征，臨床較難鑒別。Th17、Treg為近幾年新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，兩者存在促炎和抑制炎癥的相反功能，在感染性疾病、自身免疫性疾病發(fā)展過程中扮演重要角色〔12〕。史廣超等〔13〕研究指出，Th17/Treg失調(diào)為真菌侵襲機(jī)體的重要途徑，由此推測，Th17/Treg失衡可能對真菌侵襲老年COPD患者存在一定影響。

既往劉兆陽〔14〕、戴克芬等〔15〕研究已證實(shí)，老年COPD患者已存在Th17/Treg免疫失衡，與肺功能正常健康人群相比，COPD患者Th17/Treg明顯上調(diào)。本研究結(jié)果表明老年COPD患者整體Th17/Treg比值處于高水平，與上述研究結(jié)果一致。

Th17、Treg隸屬于CD4 T淋巴細(xì)胞，Th17由激活的CD4+T細(xì)胞在白細(xì)胞介素(IL)-21與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β或IL-6與TGF-β的相互作用下，經(jīng)STAT3通路最終分化而來，其主要功能為分泌IL-17、IL-22等炎癥因子，使炎癥反應(yīng)加劇〔16〕。Treg由胸腺及外周CD4+T細(xì)胞分化，主要分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，是一類具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)的T細(xì)胞亞群，其主要功能為誘導(dǎo)和維持機(jī)體的免疫耐受，保持機(jī)體自身免疫平衡〔17〕。免疫反應(yīng)在COPD發(fā)生發(fā)展的重要作用已得到公認(rèn)，在常態(tài)下，Treg與Th17既有相互拮抗作用同時(shí)又保持動(dòng)態(tài)平衡，COPD患者氣道長期反復(fù)暴露于感染、刺激性煙霧等有害因素下，不斷刺激并活化Th17，Th17產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)超過了Treg的抗炎效應(yīng)，Th17與Treg的動(dòng)態(tài)平衡被打破，使得炎癥持續(xù)進(jìn)展導(dǎo)致肺損傷和肺氣腫形成〔18〕。本研究結(jié)果表明，老年COPD患者繼發(fā)真菌感染后，以往高水平Th17/Treg會(huì)一定程度下降。張亞武〔19〕研究發(fā)現(xiàn)繼發(fā)真菌感染老年獲得性免疫缺陷綜合征患者Th17/Treg比值顯著低單純老年獲得性免疫缺陷綜合征患者，與本研究結(jié)果相似。當(dāng)真菌入侵機(jī)體后，會(huì)刺激機(jī)體分化出Th17細(xì)胞，并觸發(fā)機(jī)體Th17型免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)〔20〕，在IL-17信號通路中缺失ACT1及IL-17RA、IL-17RC因子的小鼠，發(fā)生真菌(假絲酵母菌)感染的機(jī)會(huì)增加。也有研究通過鼻內(nèi)途徑使小鼠肺部感染真菌(曲霉菌)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17和IL-23可發(fā)揮抗真菌免疫反應(yīng)，主要機(jī)制為IL-17和IL-23可抑制干擾素(IFN)-γ、IL-12等因子介導(dǎo)的Th1保護(hù)性反應(yīng)，造成Th1細(xì)胞失控〔21〕。由此可見，Th17水平的下降削弱了機(jī)體抗真菌免疫反應(yīng)。研究表明〔4〕，真菌侵襲機(jī)體后，感染早期Treg通過分泌IL-10及調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性T細(xì)胞來控制過度的炎癥反應(yīng)，感染晚期可通過抑制Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來控制炎癥發(fā)展，減輕炎癥對機(jī)體組織產(chǎn)生的病理損傷。但Treg過度的免疫抑制有可能阻礙Th17對真菌的清除作用。由此可見，Th17/Treg比值的下調(diào)為真菌入侵提供了重要契機(jī)。實(shí)際臨床工作中，醫(yī)生可結(jié)合患者實(shí)際情況，若COPD患者存在長期激素或抗菌藥使用史、住院時(shí)間較長等高危因素，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Th17/Treg比值在原基礎(chǔ)上下調(diào)，應(yīng)高度懷疑患者繼發(fā)真菌感染，并完善相關(guān)檢查予以確診和治療。本研究經(jīng)線性回歸分析再次證實(shí)，Th17/Treg細(xì)胞失衡對真菌侵襲老年COPD患者有重要影響。

綜上，Treg與Th17在COPD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，同時(shí)Treg/Th17失衡為真菌侵襲老年COPD患者提供重要契機(jī)，但其作用機(jī)制相關(guān)研究較少，有待臨床進(jìn)一步擴(kuò)大樣本探究。