任一杰，趙小亮，王寶忠，向紫駿，楊超福，王海利，馬君義，張偉杰

（1.甘肅隴神戎發(fā)藥業(yè)股份有限公司，甘肅 蘭州 730102；2.甘肅省中藥固體分散制劑重點實驗室，甘肅 蘭州 730102；3.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050；4.西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070）

油橄欖（Olea europaeaL.）系木犀科木犀欖屬常綠喬木，是重要的木本油料和果用樹種，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，在我國甘肅、云南、四川和福建等地有廣泛分布[1-3]，現(xiàn)有種植面積已超過120 萬畝。油橄欖樹在進行修剪和果實采摘過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物油橄欖葉，目前對于油橄欖葉沒有進行有效的利用。研究發(fā)現(xiàn)，油橄欖葉中含有黃酮、多酚、多糖等生物活性成分[4-6]，多糖作為生物大分子具有重要的生理活性，在食品、化妝品、保健品、藥品和醫(yī)用材料等領域已有廣泛應用[7-9]。

多糖由于其多羥基的結構特點，易溶于水，不溶于乙醇等有機溶劑。熱水提取法是目前多糖提取中最常用的方法，材料經(jīng)過粉碎、脫脂等前處理后經(jīng)熱水提取，提取液加入一定濃度的乙醇，收集沉淀可獲得粗多糖。除此之外，微波、超聲波、超臨界萃取、超高壓等技術也可用于多糖的輔助提取，也有通過酶的作用破壞細胞壁來提高多糖的提取效果[10]。利用油橄欖葉提取多糖，不僅能夠充分利用油橄欖葉這一資源，同時也可以為功能性多糖提供新的來源。鄧建梅等[11]通過微波輔助提取油橄欖葉多糖，在最佳工藝條件下油橄欖葉的多糖得率為12.4535 mg/g。原姣姣等[12]通過響應面優(yōu)化了超聲-酶輔助油橄欖葉多糖的提取工藝，發(fā)現(xiàn)先用酶解處理，之后再進行超聲提取可以提高提取率，在優(yōu)化的工藝條件下油橄欖葉多糖的提取率可以達到4.50%。王布雷等[13]從油橄欖葉提取了一種由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成的酸性雜多糖，活性研究發(fā)現(xiàn)該多糖具有良好的抗氧化作用，對革蘭氏陰性細菌的抑制能力強于革蘭氏陽性細菌。而對于油橄欖葉多糖的精細結構及活性方面的深入研究相對較少，多糖的結構復雜，活性與結構密切相關，研究發(fā)現(xiàn)不同的方法提取獲得的多糖組成不同，結構和性質(zhì)存在差異，造成多糖的活性不穩(wěn)定及質(zhì)量控制難度大。熱水提取是多糖最常用的提取方法，方法穩(wěn)定，重復性好，獲得的多糖結構穩(wěn)定。因此，本研究采用正交試驗優(yōu)化油橄欖葉多糖的熱水提取工藝，通過紅外光譜、分子量及單糖組成分析進行多糖結構的初步分析，并評價多糖的抗氧化活性，為油橄欖葉多糖的進一步開發(fā)利用提供參考，為油橄欖葉的綜合利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油橄欖葉 采于甘肅省隴南市，經(jīng)鑒定為木犀科植物油橄欖（Olea europaeaL.）的葉子；乙腈 色譜純，德國Merck 公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、系列單糖標準品（甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖） 分析純，Sigma-Aldrich 公司；其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

AB104-N 型分析天平 梅特勒-托利多儀器公司；FD-1-55 型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RE-52CS-2 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-IIIA 型循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-9200 紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；Agilent1260 高效液相色譜儀、Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）美國安捷倫公司；Frontier 紅外光譜儀 美國Perkin Elmer 公司；Dawn 型多角度激光光散射儀美國Wyatt 公司；OHpak SB-806M HQ 凝膠色譜柱（8.0 mm×300 mm） 日本昭和電工；TG16-WS 型低速大容量離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油橄欖葉前處理 油橄欖葉陰涼處晾干后粉碎機粉碎，過60 目篩，用80%乙醇80 ℃加熱回流脫脂4 次，每次2 h，脫脂后的油橄欖葉粉末干燥后備用[14]。

1.2.2 油橄欖葉多糖提取單因素實驗 以影響多糖得率的料液比、溫度和時間為考察因素，研究不同單因素對油橄欖葉多糖得率的影響。分別稱取脫脂后油橄欖葉粉末2 g 于三口燒瓶中，置恒溫磁力加熱攪拌器水浴中分別按以下條件提?。涸?0 ℃、提取時間為3 h 條件下，考察提取料液比（1:20、1:25、1:30、1:35 和1:40 g/mL）對多糖得率的影響；在料液比為1:30 g/mL、提取時間為3 h 的條件下，考察提取溫度（50、60、70、80、90、95 ℃）對多糖得率的影響；在料液比為1:30 g/mL、提取溫度為80 ℃的條件下，考察提取時間（1、2、3、4 和5 h）對多糖得率的影響[15]。每組實驗重復3 次，計算多糖得率。

1.2.3 正交試驗設計 在1.2.2 單因素實驗的基礎上，對3 個影響因素進行三因素三水平L9（34）正交試驗，根據(jù)多糖得率對結果進行分析[16]，正交試驗設計因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal assay factors and levels

1.2.4 多糖得率的計算 采用硫酸-苯酚法[17]測定總糖含量，參考文獻[18]按以下公式計算不同條件下油橄欖葉的多糖得率：

1.2.5 油橄欖葉多糖的純化 根據(jù)正交試驗優(yōu)化的提取工藝條件提取油橄欖葉多糖，提取液經(jīng)減壓濃縮，乙醇沉淀后復溶于蒸餾水，用透析袋（截留分子量為7 kDa）對蒸餾水透析3 d，透析液減壓濃縮后冷凍干燥，得油橄欖葉多糖OLP，用于后續(xù)理化性質(zhì)分析及抗氧化活性評價[18]。

1.2.6 紅外光譜分析 油橄欖葉多糖置于裝有P2O5的真空干燥箱中，50 ℃真空干燥至恒重，后取2～3 mg用KBr 壓片，在4000～400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，記錄紅外光譜圖[19]。

1.2.7 分子量分析 高效凝膠滲透色譜-多角度激光光散射儀聯(lián)用（HPGPC-MALLS）測定分子量，OLP用0.1 mol/L Na2SO4溶液溶解為5 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。分析用色譜柱為OHpak SB-806M HQ，流動相為0.1 mol/L Na2SO4溶液，進樣量100 μL，流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，示差檢測器（RID）和多角激光光散射儀（MALLS）串聯(lián)在線檢測，用Astra 5.3.4.20 工作軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算OLP 重均分子量（Mw）、數(shù)均分子量（Mn）以及分散系數(shù)[20-21]。

1.2.8 單糖組成分析 采用PMP 柱前衍生高效液相色譜法測定油橄欖葉多糖的單糖組成。取OLP 3 mg溶于300 μL 2 mol/L 三氟乙酸（TFA），加入安瓿瓶后封口，在105 ℃條件下水解6 h，水解液氮吹儀吹干后反復加甲醇3 次吹干，除去TFA[22]。水解產(chǎn)物溶解于100 μL 蒸餾水中，加入100 μL 0.3 mol/L NaOH和120 μL 0.5 mol/L PMP 溶液在70 ℃水浴中反應1 h，反應物冷卻后加入100 μL 0.3 mol/L HCl 溶液中和，后用三氯甲烷萃取3 次以除去未反應的PMP，收集水相經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，備用。不同單糖標準品采用同樣方法進行衍生和處理[23-24]。

HPLC 測定單糖組成色譜分析條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為磷酸鹽緩沖液:乙腈=83:17（V/V），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測器245 nm 在線檢測，根據(jù)標準品和樣品出峰時間確定單糖種類，根據(jù)峰面積計算各單糖相對摩爾比[23-24]。

1.2.9 抗氧化活性的評價 取1.2.5 所得OLP，用蒸餾水配制濃度分別為0.1、0.25、0.5、1、2.5 和3 mg/mL溶液，按以下方法進行抗氧化活性評價。

羥自由基清除能力測定：分別取不同濃度OLP 1 mL 于試管中，等體積蒸餾水作為空白對照，依次加入9 mmol/L Fe2SO4溶液1 mL、8.8 mmol/L H2O21 mL和9 mmol/L 水楊酸溶液1 mL 后混勻，在37 ℃水浴恒溫反應15 min，VC作為陽性對照，在510 nm 處測定吸光值[25-26]。用公式（1）計算樣品對羥基自由基的清除率：

式中：A0：空白對照組吸光值；A：樣品吸光值。

超氧陰離子清除能力測定：分別取不同濃度OLP 1 mL 于試管中，等體積蒸餾水為空白對照，立即加入3 mL 0.05 mol/L Tris-HCl （pH8.2）溶液混勻，37 ℃水浴加熱10 min 后加入2 mL 30 mmol/L鄰苯三酚溶液反應5 min，加入1 mL 8 mol/L HCl 中止反應，VC作為陽性對照，320 nm 處測定吸光值[25-26]。代入公式（1）計算樣品對超氧陰離子自由基的清除率。

DPPH 自由基清除能力測定：分別取不同濃度OLP 2 mL 于試管中，等體積蒸餾水為空白對照，分別加入2 mL 0.1 mmol/mL DPPH 乙醇溶液混勻，避光靜置30 min，VC作為陽性對照。517 nm 處測定吸光值[25-26]。代入公式（1）計算樣品對DPPH 自由基的清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均進行3 次重復，結果用平均值±標準偏差表示，采用Origin 9.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖；利用SPSS 17.0 軟件進行IC50計算。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對多糖得率的影響 從圖1 可以看出，在料液比為1:20～1:30 g/mL 時，隨著提取溶劑量的增加，油橄欖葉多糖的得率在不斷增加，當料液比達到1:30 g/mL 時多糖得率為2.13%，經(jīng)過顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)繼續(xù)增加提取溶劑的量多糖得率沒有明顯增加，說明多糖的溶出達到了平衡，從節(jié)約溶劑以及后續(xù)多糖提取液濃縮能耗的角度考慮，選擇料液比1:30 g/mL為正交試驗設計的中心值。

圖1 料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effects of material-liquid ratio on the yield of polysaccharides

2.1.2 溫度對多糖得率的影響 從圖2 可以看出，提取溫度對OLP 得率有明顯的影響，隨著溫度的升高，多糖得率也在增加，隨著溫度的升高油橄欖葉細胞壁的破壞程度也增加，有利于多糖的溶出，當溫度達到90 ℃時多糖得率為2.03%，從提取過程水浴加熱方式溫度的限制及提取溫度升高造成溶劑揮發(fā)等方面考慮，選擇90 ℃為正交試驗工藝優(yōu)化的中心值。

圖2 溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effects of temperature on the yield of polysaccharides

2.1.3 時間對多糖得率的影響 從圖3 可以看出，隨著提取時間的延長OLP 得率明顯增加，在1～3 h 范圍內(nèi)，時間的延長對OLP 得率影響顯著（P＜0.05），提取時間達到3 h 時，多糖得率為1.95%，經(jīng)過顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)3 h 后繼續(xù)延長提取時間多糖得率增加不顯著（P＞0.05），從節(jié)約成本和時間考慮，選擇3 h 為后續(xù)正交試驗工藝優(yōu)化的中心值。

圖3 時間對多糖得率的影響Fig.3 Effects of time on the yield of polysaccharides

2.2 正交試驗結果及分析

2.2.1 正交試驗結果 根據(jù)2.1 單因素實驗結果可知，選取影響OLP 得率的料液比、溫度和時間三個因素，采用標準L9（34）正交試驗設計進行提取工藝優(yōu)化，正交試驗及試驗結果見表2。

表2 L9（34）正交實驗及結果Table 2 L9(34) orthogonal design and experiment results

從表2 正交試驗結果極差分析可以看出，3 個提取因素對OLP 得率影響的順序為B＞A＞C，即溫度對OLP 得率的影響最大，其次是料液比和時間，最佳提取條件為A1B3C3，即料液比為1:27.5 g/mL，在溫度95 ℃下提取3.5 h。

2.2.2 工藝驗證試驗 根據(jù)2.2.1 正交試驗工藝優(yōu)化結果，取油橄欖脫脂粉末2.0 g，3 份，按照A1B3C3條件進行OLP 提取工藝驗證試驗，測定提取液多糖含量，計算OLP 得率。計算結果得率分別為2.77%、2.75%和2.74%，平均得率為2.75%，高于正交試驗設計中所有條件下OLP 得率，表明工藝優(yōu)化成功。該工藝油橄欖葉多糖的得率高于鄧建梅等[11]采用微波輔助提取的多糖得率（12.4535 mg/g），低于原姣姣等[12]采用的超聲-酶輔助提取的得率（4.50%），相比而言，本研究多糖的得率較高，并且提取條件簡單，成本較低，易于大規(guī)模制備。

2.3 油橄欖葉多糖紅外光譜分析結果

從圖4 可知，OLP 的紅外光譜圖中可以看出OLP具有多糖的一般吸收特征峰，3427 cm-1處的吸收峰為糖結構中-OH 的O-H 的伸縮振動吸收峰，2935 cm-1處吸收峰為糖結構中C-H 特征吸收峰，1747、1631、1439 cm-1這3 處為C=O 和O-H 特征吸收峰，1100～1022 cm-1為吡喃糖殘基糖環(huán)C-O-C和C-O-H 吸收[7]。通過紅外光譜分析說明所制備的OLP 為糖類化合物[19]。

圖4 OLP 紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of OLP

2.4 分子量分析結果

采用HPGPC-MALLS 法對OLP 的分子量進行了分析測定，結果見表3。

表3 OLP 分子量分析結果Table 3 OLP molecular weight analysis results

從表3 可知，OLP 的重均分子量（Mw）和數(shù)均分子量分別為25.36 和19.32 kDa，多分散系數(shù)為1.313，表明OLP 的分子量分布范圍較窄。

2.5 油橄欖葉單糖組成分析結果

采用PMP 柱前衍生-HPLC 法分析OLP 的單糖組成，單糖組成HPLC 結果見圖5，單糖組成分析結果及相對摩爾比見表4。從圖5 和表4 可知，OLP 為含有8 種單糖的雜多糖，主要由葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和氨基半乳糖（GalN）組成，此外還含有鼠李糖（Rha）和阿拉伯糖（Ara），以及少量的木糖（Xyl）、甘露糖（Man）和氨基葡萄糖（GlcN），各種單糖的相對摩爾比如表4，其中Glc 所占比例最大。王布雷等[13]也對提取的油橄欖葉多糖的單糖組成進行了分析，發(fā)現(xiàn)其由7 種單糖組成，其中Gal 占比最大，為31.17%，其次是Glc 和Ara，占比分別為29.30%和21.64%，此外還含有GalA（6.95%）、Rha（5.67%）、GlcA（3.11%）和Man（2.17%），為含有糖醛酸的酸性多糖。研究發(fā)現(xiàn)，原料的產(chǎn)地、年限及處理工藝[27-28]、多糖的提取方法等均會對多糖的單糖組成和活性產(chǎn)生影響[29-30]，該研究與本研究所獲油橄欖葉多糖在單糖組成上存在明顯不同，可能是該研究所用油橄欖葉為四川西昌所產(chǎn)，與本研究所用材料的產(chǎn)地以及提取方法等不同有關，這也說明多糖的來源及提取方法會對多糖的結構產(chǎn)生影響。

圖5 OLP 單糖組成分析HPLC 圖Fig.5 Monosaccharide composition analysis of OLP by HPLC

表4 OLP 單糖組成及相對摩爾比分析結果Table 4 The analysis results of monosaccharide composition and relative mole ratio

2.6 油橄欖葉多糖抗氧化活性

2.6.1 對羥自由基的清除活性 OLP 和VC對羥自由基的清除活性見圖6。

圖6 OLP 對羥自由基的清除活性Fig.6 Scavenging activity of OLP on hydroxyl free radical

從圖6 可知，OLP 對羥自由基有一定的清除活性，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關系，在濃度0.1～3 mg/mL范圍內(nèi)隨著濃度的增加，清除活性明顯增強，濃度為3 mg/mL 時，清除率達到了83.32%，經(jīng)計算OLP 和VC對羥自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.422和0.044 mg/mL，表明OLP 對羥自由基具有較好的清除活性，在一定濃度范圍內(nèi)可以發(fā)揮清除羥基自由基的活性。

2.6.2 對超氧陰離子自由基的清除活性 OLP 和VC對超氧陰離子自由基的清除活性見圖7。

由圖7 可知，OLP 對超氧陰離子自由基有明顯的清除活性，在濃度0.1～1 mg/mL 范圍內(nèi)隨著濃度的增加清除活性明顯增強，呈現(xiàn)濃度依賴關系，當濃度為2.5 mg/mL 時，清除率達到了85.13%，經(jīng)計算OLP 和VC對超氧陰離子自由基的IC50分別為0.302和0.139 mg/mL，表明OLP 對超氧陰離子自由基具有較好的清除活性。

圖7 OLP 對超氧陰離子自由基的清除活性Fig.7 Scavenging activity of OLP on superoxide anion free radical

2.6.3 對DPPH 自由基的清除活性 OLP 和VC對DPPH 自由基的清除活性見圖8。

由圖8 可知，隨著OLP 濃度的增加對DPPH 自由基的清除活性與VC具有相同的作用趨勢，均表現(xiàn)出明顯的濃度依賴關系，濃度達到3 mg/mL 時清除率達到82.26%，經(jīng)計算OLP 和VC對DPPH 自由基的IC50分別為0.268 mg/mL 和0.073 mg/mL，表明OLP 對DPPH 自由基有較好的清除活性。

圖8 OLP 對DPPH 自由基的清除活性Fig.8 Scavenging activity of OLP on DPPH free radical

通過比較發(fā)現(xiàn)OLP 對DPPH 的清除活性最強，其次是超氧陰離子自由基和羥自由基，表明OLP 對不同類型的自由基均有較好的清除活性，可以用于天然抗氧化劑的開發(fā)，保護機體免受自由基損傷，有進一步開發(fā)和應用的前景。

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上通過正交試驗優(yōu)化了油橄欖葉多糖的提取工藝，發(fā)現(xiàn)提取時間對多糖得率影響最大，在最佳提取工藝條件料液比1:27.5 g/mL，溫度95 ℃，提取時間3.5 h 下，多糖得率為2.75%，分析發(fā)現(xiàn)油橄欖葉多糖主要是由Glc、Gal 和GalN等單糖組成的雜多糖，分子量分布窄，純度較好，能夠清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH 自由基，具有較好的體外抗氧化活性。本研究為油橄欖葉多糖的進一步研究以及開發(fā)利用提供了參考。