馬東霞，黃南，李文靜，楊雅琪，蔣晴，陳浩，張書辰，汪茵，楊林，祝戎飛

近年來氣道過敏性疾病患病率在全球范圍內呈上升趨勢，過敏性哮喘是氣道過敏性疾病的重要組成部分，是兒童支氣管哮喘的主要組成部分，同時占成人支氣管哮喘的50%，在導致過敏性哮喘的過敏原中，屋塵螨(house dust mite，HDM)是主要的過敏原，其分布廣泛，并且難以避免[1]。過敏性哮喘是一種異質性炎癥性肺病，是機體對過敏原產生的以 Th2 細胞異常免疫應答為主的氣道可逆性氣流受限的一種氣道慢性炎癥。特異性變應原Th2細胞的激活及其分泌的IL- 4、 IL- 5 與IL-13等在維持過敏原特異性IgE水平、嗜酸性粒細胞增多、組織炎癥和損傷等方面發(fā)揮關鍵作用，從而導致嚴重的臨床表現和慢性炎癥[2- 3]。而Th1 細胞分化不足，進而分泌的IFN-γ、IL- 2等因子減少，抑制Th2分化的作用減弱，進而促進T細胞向Th2細胞方向分化，IL- 4、IL- 5等Th2 型細胞因子分泌增多，進一步加重Th1/Th2細胞失衡，促進過敏性哮喘的進展[1]。

胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide-1，GLP-1) 是由小腸 L 細胞分泌的葡萄糖依賴性的腸降血糖多肽激素，常用于糖尿病治療[4- 5]。近年來研究發(fā)現 GLP-1 類似物利拉魯肽可以降低由卵清蛋白與脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) 誘導的阻塞性肺疾病的發(fā)病率及死亡率，改善肥胖相關性哮喘；GLP-1 類似物Exendin- 4 (Ex- 4) 改善高糖誘導的離體人細支氣管氣道高反應性[6- 8]。由此，推測GLP-1對HDM誘導的過敏性氣道炎癥有抑制作用。

為驗證以上假設，本研究選用引起過敏性哮喘最常見的過敏原HDM，構建小鼠過敏性哮喘模型，應用臨床常用的GLP-1類似物利拉魯肽干預小鼠，探討GLP-1對小鼠過敏性哮喘的影響，并分析其對Th1、Th2細胞炎性因子分泌的作用，進一步明確 GLP-1 在過敏性哮喘生物學功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性C57/BL6(H- 2b)小鼠，體重20～23 g，6～8周齡，24只，購于北京維通利華生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院科研中心。

1.1.2 實驗試劑及主要儀器：HDM提取物購自北京博蕾德科技發(fā)展有限公司；FACS相關實驗試劑和抗體CD4-Bv510、CD8-APC、IFN-γ-FITC、IL- 4-PE，購自BD Pharmingen；IL- 4、IL- 5、IL-13 ELISA試劑盒購自聯科生物；劉氏染液購于Baso Diagnostics INC.Zhuhai；Fixation Buffer和 Intracellular Staining Perm Wash Buffer及Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) 購于Thermo Fisher Scientific 公司。流式細胞儀購于BD FACSCelesta公司，酶標儀購于 BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠過敏性哮喘模型的建立：將24只SPF級C57/BL6 小鼠隨機分為Con組、GLP-1組、屋塵螨(HDM)組、屋塵螨+GLP-1(HDM+GLP-1)組。HDM組，給予 HDM 鼻腔滴注，即從第 1 天(d1)至第 3 天(d3)通過鼻腔滴注連續(xù)給予 50 μg/50 μL的無菌HDM，然后從第 14 天(d14)到第17 天(d17)通過鼻腔滴注連續(xù)給予 5 μg/50 μL的無菌HDM 建立小鼠 HDM 過敏性氣道炎癥模型；并皮下注射200 μL生理鹽水，注射時間同HDM+GLP-1組。HDM+GLP-1組小鼠從d3開始皮下注射GLP-1類似物利拉魯肽(0.2 mg/kg，利拉魯肽Novo Nordisk，Novo Alle，Bagsvaerd，Denmark，溶于200 μL生理鹽水中，q12h，利拉魯肽在小鼠中所用劑量及干預方式借鑒文獻[9-10]報道)，HDM鼻腔滴注方案同HDM組。GLP-1組小鼠皮下注射利拉魯肽，并給予50 μL生理鹽水鼻腔滴注，方案同HDM+GLP-1組。Con給予50 μL生理鹽水鼻腔滴注，200 μL生理鹽水皮下注射，處理時間同HDM+GLP-1組。各組小鼠均于最后1次鼻腔滴注后24 h處死取標本。

1.2.2 小鼠肺臟組織病理學觀察：上述各組小鼠取小鼠右肺組織，PBS清洗后，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液炎癥細胞檢測：以1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射，麻醉小鼠，小鼠仰臥位固定解剖板上，剪開頸部皮膚暴露氣管，將注射器7號針頭針尖去除，并磨平，在氣管上部插入并縫合線固定，1 mL注射器灌注3次，每次灌注0.7 mL預冷的PBS。將收集的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)混合均勻，取 20 μL BALF 用細胞計數儀計數，另取80 μL BALF甩片，進行劉氏染色。計數中性粒細胞數、巨噬細胞數、嗜酸性粒細胞數和淋巴細胞數。剩余BALF于4 ℃，450 g離心10 min。上清分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.4 流式細胞術檢測小鼠支氣管肺門淋巴結Th1/Th2水平：在顯微鏡下摘取小鼠支氣管肺門淋巴結，置于含有1%青霉素鏈霉素的PBS中，沖洗兩次后，在無菌操作臺，移于200目無菌濾網上，浸于1%青霉素鏈霉素的PBS，無菌眼科剪刀剪碎組織，1 mL注射器活塞橡膠端研磨，收集研磨液，300 g離心7 min。棄上清，重懸于RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調整細胞濃度1×106/mL，加入1×Cell Stimulation Cocktail，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。

將上述細胞收集在相應流式管內，加入3 mL PBS輕輕吹打均勻，300 g離心7 min，加入100 μL 含有 CD4 與CD8的PBS，避光，4 ℃ 孵育30 min，加入4 mL PBS離心，棄去上清液。加入2 mL fixation Buffer，4 ℃孵育45 min，離心后棄除上清，加入100 μL含有IFN-γ、IL- 4、IL-17抗體的1× Intracellular Staining Perm Wash Buffer，4 ℃孵育30 min，加入4 mL 1× Intracellular Staining Perm Wash Buffer離心，棄去上清液，然后加入200 μL 1× Intracellular Staining Perm Wash Buffer重懸細胞，流式檢測。

1.2.5 ELISA檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液炎癥因子濃度：取適量上述BALF上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測IL- 4、IL- 5、IL-13炎性因子水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 小鼠肺臟組織病理學變化

小鼠肺組織HE染色結果顯示，HDM 組小鼠肺組織切片小支氣管及血管周圍均見明顯的炎性細胞浸潤，支氣管上皮細胞可見部分斷裂及脫落；GLP-1干預后組炎癥反應明顯減輕；Con組及GLP-1組小鼠肺組織切片未見顯著病理性改變，支氣管結構規(guī)則且完整，較HDM組及HDM+GLP-1組病理損傷明顯減輕(圖1)。

圖1 GLP-1抑制HDM誘導的小鼠過敏性哮喘氣道炎癥

2.2 支氣管肺泡灌洗液炎癥細胞水平

HDM組小鼠BALF中巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞較Con組及GLP-1組顯著增加；HDM+GLP-1組較HDM組嗜酸性粒細胞及巨噬細胞均顯著減少(P<0.01及P<0.05)，中性粒細胞及淋巴細胞也有一定減少，但無統計學意義(圖2)。

圖2 GLP-1對HDM誘導小鼠過敏性哮喘BALF中炎癥細胞數的影響

2.3 流式細胞術檢測小鼠支氣管肺門淋巴結中Th1/Th2水平

顯微鏡下可見HDM組小鼠支氣管肺門淋巴結明顯增大，而Con組及GLP-1組小鼠，支氣管肺門淋巴結未見明顯增大。圖3流式細胞術檢測顯示，HDM+GLP-1組小鼠支氣管肺門淋巴結中CD4+IL- 4+較HDM組小鼠比例顯著降低(P<0.05)，同時CD4+IFN-γ+細胞比例較HDM組小鼠明顯增多(P<0.01)，差異具有統計學意義。同時發(fā)現兩組小鼠支氣管肺門淋巴結中CD8+IFN-γ+比例與CD4+IFN-γ+細胞變化一致，HDM+GLP-1組顯著升高(P<0.01)；GLP-1干預的哮喘模型組CD8+IL- 4+較HDM組有下降趨勢。

圖3 GLP-1對HDM誘導過敏性哮喘小鼠支氣管和肺門淋巴結Th1 (CD4/CD8+IFN-γ+)細胞和Th2 (CD4/CD8+IL- 4+)細胞分化的影響

2.4 小鼠支氣管肺泡灌洗液炎癥因子濃度

用ELISA檢測小鼠BALF中Th2型炎癥因子IL- 4、IL- 5、IL-13水平，結果顯示HDM+GLP-1組小鼠BALF中IL- 4、IL- 5、IL-13水平較HDM組顯著降低(分別P<0.01，P<0.05，P<0.01)(圖4)。

圖4 GLP-1對HDM誘導過敏性哮喘小鼠Th2型炎癥細胞因子水平的影響

3 討論

支氣管哮喘作為一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，近年來被認為是一種綜合診斷，包括多種不同的臨床表現(表型)和不同的病理生理機制(內生型)[4，6]。過敏性哮喘是最常見的哮喘表型，具有發(fā)病早、對變應原敏感、與IgE相關，由Th2細胞介導的一種疾病亞型[7，9]。免疫反應的啟動，通常始于變應原特異性Th2細胞的激活和分化，并由變應原觸發(fā)。2型免疫細胞分泌的2型細胞因子(IL- 4、IL- 5、IL-13)在過敏性哮喘中有重要作用。而Th1型免疫反應減弱也是過敏性哮喘發(fā)生的重要因素，適量的Th1細胞相關因子IFN-γ可以抑制T細胞向Th2細胞分化，因此適當提高Th1型細胞反應可負向調節(jié)過敏性哮喘的進展[10]。目前有學者根據過敏性哮喘的具體分子機制將哮喘分為不同的內生型，在此基礎上，隨著新型生物療法的發(fā)展，傳統哮喘治療無效的患者可以給予抗lgE、抗IL- 5、抗IL- 4/IL-13等新型生物藥物控制哮喘癥狀，改善病情[11-13]。生物分子靶向治療可較好的控制病情，不過由于費用較高，在臨床應用中受到一定限制[12]。

GLP-1是一種代謝激素，由小腸L細分泌，可與廣泛分布的受體(GLP-1R)相互作用，觸發(fā)胰島素產生、葡萄糖攝取、食欲下降等[14]。GLP-1R在肺中表達豐富，可刺激血管擴張、表面活性劑的產生和支氣管擴張。近年來研究發(fā)現GLP-1類似物利拉魯肽可以改善肥胖相關哮喘的病情[15]。GLP-1R激動劑可作為一種臨床應用安全，實驗室和臨床研究均可立即使用的藥物。將來通過進一步研究，GLP-1R激動劑或許可作為一種所謂的新型藥物，用于治療哮喘、肥胖和糖尿病合并患者[16]。

本研究應用GLP-1類似物利拉魯肽干預由屋塵螨誘導的小鼠過敏性哮喘模型，發(fā)現GLP-1類似物能夠顯著抑制小鼠過敏性氣道炎癥，炎癥細胞浸潤明顯減少。GLP-1干預的小鼠過敏性哮喘模型組BALF中嗜酸性粒細胞及巨噬細胞較HDM組顯著減少，嗜酸性粒細胞及2型巨噬細胞在T細胞向Th2細胞分化中有重要作用[17-18]。為進一步研究GLP-1抑制氣道過敏性炎癥的機制，本研究在顯微鏡下摘取支氣管肺門淋巴結，并用流式細胞術檢測其中CD4/CD8+IFN-γ+及CD4/CD8+IL- 4+比例，發(fā)現支氣管肺門淋巴結中CD4/CD8+IL- 4+細胞比例降低，而CD4/CD8+IFN-γ+細胞比例升高，調整了Th1/Th2細胞平衡。有學者提出過敏性哮喘主要與CD4+Th2細胞有關，而本研究發(fā)現在HDM誘導的小鼠過敏性哮喘模型中，CD8+IL- 4+細胞也呈現顯著增高，其在過敏性哮喘中可能有重要作用；同時用GLP-1干預的小鼠哮喘模型組，CD8+IFN-γ+比例較模型組顯著升高，CD8+IL- 4+細胞比例有一定的下降。進一步用ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子水平，結果與Th細胞變化一致，GLP-1類似物干預可以降低Th2型炎癥因子水平。本研究證實GLP-1在HDM誘導的小鼠過敏性哮喘模型中可以調節(jié)T細胞分化，促進Th1/Th2細胞再平衡，但其具體機制有待于進一步研究。

本研究證實GLP-1能抑制HDM所致過敏性氣道炎癥，其可能通過調節(jié)T細胞向Th1/Th2細胞分化再平衡發(fā)揮作用，為過敏性哮喘患者提供了新的治療思路及理論依據，尤其可為糖尿病合并過敏性哮喘患者提供理想的治療手段。