馬東霞，黃南，李文靜，楊雅琪，蔣晴，陳浩，張書辰，汪茵，楊林，祝戎飛

近年來氣道過敏性疾病患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，過敏性哮喘是氣道過敏性疾病的重要組成部分，是兒童支氣管哮喘的主要組成部分，同時占成人支氣管哮喘的50%，在導(dǎo)致過敏性哮喘的過敏原中，屋塵螨(house dust mite，HDM)是主要的過敏原，其分布廣泛，并且難以避免[1]。過敏性哮喘是一種異質(zhì)性炎癥性肺病，是機(jī)體對過敏原產(chǎn)生的以 Th2 細(xì)胞異常免疫應(yīng)答為主的氣道可逆性氣流受限的一種氣道慢性炎癥。特異性變應(yīng)原Th2細(xì)胞的激活及其分泌的IL- 4、 IL- 5 與IL-13等在維持過敏原特異性IgE水平、嗜酸性粒細(xì)胞增多、組織炎癥和損傷等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)和慢性炎癥[2- 3]。而Th1 細(xì)胞分化不足，進(jìn)而分泌的IFN-γ、IL- 2等因子減少，抑制Th2分化的作用減弱，進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向分化，IL- 4、IL- 5等Th2 型細(xì)胞因子分泌增多，進(jìn)一步加重Th1/Th2細(xì)胞失衡，促進(jìn)過敏性哮喘的進(jìn)展[1]。

胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide-1，GLP-1) 是由小腸 L 細(xì)胞分泌的葡萄糖依賴性的腸降血糖多肽激素，常用于糖尿病治療[4- 5]。近年來研究發(fā)現(xiàn) GLP-1 類似物利拉魯肽可以降低由卵清蛋白與脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) 誘導(dǎo)的阻塞性肺疾病的發(fā)病率及死亡率，改善肥胖相關(guān)性哮喘；GLP-1 類似物Exendin- 4 (Ex- 4) 改善高糖誘導(dǎo)的離體人細(xì)支氣管氣道高反應(yīng)性[6- 8]。由此，推測GLP-1對HDM誘導(dǎo)的過敏性氣道炎癥有抑制作用。

為驗(yàn)證以上假設(shè)，本研究選用引起過敏性哮喘最常見的過敏原HDM，構(gòu)建小鼠過敏性哮喘模型，應(yīng)用臨床常用的GLP-1類似物利拉魯肽干預(yù)小鼠，探討GLP-1對小鼠過敏性哮喘的影響，并分析其對Th1、Th2細(xì)胞炎性因子分泌的作用，進(jìn)一步明確 GLP-1 在過敏性哮喘生物學(xué)功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：健康雄性C57/BL6(H- 2b)小鼠，體重20～23 g，6～8周齡，24只，購于北京維通利華生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院科研中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器：HDM提取物購自北京博蕾德科技發(fā)展有限公司；FACS相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑和抗體CD4-Bv510、CD8-APC、IFN-γ-FITC、IL- 4-PE，購自BD Pharmingen；IL- 4、IL- 5、IL-13 ELISA試劑盒購自聯(lián)科生物；劉氏染液購于Baso Diagnostics INC.Zhuhai；Fixation Buffer和 Intracellular Staining Perm Wash Buffer及Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) 購于Thermo Fisher Scientific 公司。流式細(xì)胞儀購于BD FACSCelesta公司，酶標(biāo)儀購于 BioTek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠過敏性哮喘模型的建立：將24只SPF級C57/BL6 小鼠隨機(jī)分為Con組、GLP-1組、屋塵螨(HDM)組、屋塵螨+GLP-1(HDM+GLP-1)組。HDM組，給予 HDM 鼻腔滴注，即從第 1 天(d1)至第 3 天(d3)通過鼻腔滴注連續(xù)給予 50 μg/50 μL的無菌HDM，然后從第 14 天(d14)到第17 天(d17)通過鼻腔滴注連續(xù)給予 5 μg/50 μL的無菌HDM 建立小鼠 HDM 過敏性氣道炎癥模型；并皮下注射200 μL生理鹽水，注射時間同HDM+GLP-1組。HDM+GLP-1組小鼠從d3開始皮下注射GLP-1類似物利拉魯肽(0.2 mg/kg，利拉魯肽Novo Nordisk，Novo Alle，Bagsvaerd，Denmark，溶于200 μL生理鹽水中，q12h，利拉魯肽在小鼠中所用劑量及干預(yù)方式借鑒文獻(xiàn)[9-10]報道)，HDM鼻腔滴注方案同HDM組。GLP-1組小鼠皮下注射利拉魯肽，并給予50 μL生理鹽水鼻腔滴注，方案同HDM+GLP-1組。Con給予50 μL生理鹽水鼻腔滴注，200 μL生理鹽水皮下注射，處理時間同HDM+GLP-1組。各組小鼠均于最后1次鼻腔滴注后24 h處死取標(biāo)本。

1.2.2 小鼠肺臟組織病理學(xué)觀察：上述各組小鼠取小鼠右肺組織，PBS清洗后，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞檢測：以1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射，麻醉小鼠，小鼠仰臥位固定解剖板上，剪開頸部皮膚暴露氣管，將注射器7號針頭針尖去除，并磨平，在氣管上部插入并縫合線固定，1 mL注射器灌注3次，每次灌注0.7 mL預(yù)冷的PBS。將收集的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)混合均勻，取 20 μL BALF 用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，另取80 μL BALF甩片，進(jìn)行劉氏染色。計數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)。剩余BALF于4 ℃，450 g離心10 min。上清分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠支氣管肺門淋巴結(jié)Th1/Th2水平：在顯微鏡下摘取小鼠支氣管肺門淋巴結(jié)，置于含有1%青霉素鏈霉素的PBS中，沖洗兩次后，在無菌操作臺，移于200目無菌濾網(wǎng)上，浸于1%青霉素鏈霉素的PBS，無菌眼科剪刀剪碎組織，1 mL注射器活塞橡膠端研磨，收集研磨液，300 g離心7 min。棄上清，重懸于RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/mL，加入1×Cell Stimulation Cocktail，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。

將上述細(xì)胞收集在相應(yīng)流式管內(nèi)，加入3 mL PBS輕輕吹打均勻，300 g離心7 min，加入100 μL 含有 CD4 與CD8的PBS，避光，4 ℃ 孵育30 min，加入4 mL PBS離心，棄去上清液。加入2 mL fixation Buffer，4 ℃孵育45 min，離心后棄除上清，加入100 μL含有IFN-γ、IL- 4、IL-17抗體的1× Intracellular Staining Perm Wash Buffer，4 ℃孵育30 min，加入4 mL 1× Intracellular Staining Perm Wash Buffer離心，棄去上清液，然后加入200 μL 1× Intracellular Staining Perm Wash Buffer重懸細(xì)胞，流式檢測。

1.2.5 ELISA檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液炎癥因子濃度：取適量上述BALF上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測IL- 4、IL- 5、IL-13炎性因子水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺臟組織病理學(xué)變化

小鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示，HDM 組小鼠肺組織切片小支氣管及血管周圍均見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞可見部分?jǐn)嗔鸭懊撀洌籊LP-1干預(yù)后組炎癥反應(yīng)明顯減輕；Con組及GLP-1組小鼠肺組織切片未見顯著病理性改變，支氣管結(jié)構(gòu)規(guī)則且完整，較HDM組及HDM+GLP-1組病理損傷明顯減輕(圖1)。

圖1 GLP-1抑制HDM誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘氣道炎癥

2.2 支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞水平

HDM組小鼠BALF中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞較Con組及GLP-1組顯著增加；HDM+GLP-1組較HDM組嗜酸性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞均顯著減少(P<0.01及P<0.05)，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞也有一定減少，但無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

圖2 GLP-1對HDM誘導(dǎo)小鼠過敏性哮喘BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)的影響

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠支氣管肺門淋巴結(jié)中Th1/Th2水平

顯微鏡下可見HDM組小鼠支氣管肺門淋巴結(jié)明顯增大，而Con組及GLP-1組小鼠，支氣管肺門淋巴結(jié)未見明顯增大。圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，HDM+GLP-1組小鼠支氣管肺門淋巴結(jié)中CD4+IL- 4+較HDM組小鼠比例顯著降低(P<0.05)，同時CD4+IFN-γ+細(xì)胞比例較HDM組小鼠明顯增多(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時發(fā)現(xiàn)兩組小鼠支氣管肺門淋巴結(jié)中CD8+IFN-γ+比例與CD4+IFN-γ+細(xì)胞變化一致，HDM+GLP-1組顯著升高(P<0.01)；GLP-1干預(yù)的哮喘模型組CD8+IL- 4+較HDM組有下降趨勢。

圖3 GLP-1對HDM誘導(dǎo)過敏性哮喘小鼠支氣管和肺門淋巴結(jié)Th1 (CD4/CD8+IFN-γ+)細(xì)胞和Th2 (CD4/CD8+IL- 4+)細(xì)胞分化的影響

2.4 小鼠支氣管肺泡灌洗液炎癥因子濃度

用ELISA檢測小鼠BALF中Th2型炎癥因子IL- 4、IL- 5、IL-13水平，結(jié)果顯示HDM+GLP-1組小鼠BALF中IL- 4、IL- 5、IL-13水平較HDM組顯著降低(分別P<0.01，P<0.05，P<0.01)(圖4)。

圖4 GLP-1對HDM誘導(dǎo)過敏性哮喘小鼠Th2型炎癥細(xì)胞因子水平的影響

3 討論

支氣管哮喘作為一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，近年來被認(rèn)為是一種綜合診斷，包括多種不同的臨床表現(xiàn)(表型)和不同的病理生理機(jī)制(內(nèi)生型)[4，6]。過敏性哮喘是最常見的哮喘表型，具有發(fā)病早、對變應(yīng)原敏感、與IgE相關(guān)，由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的一種疾病亞型[7，9]。免疫反應(yīng)的啟動，通常始于變應(yīng)原特異性Th2細(xì)胞的激活和分化，并由變應(yīng)原觸發(fā)。2型免疫細(xì)胞分泌的2型細(xì)胞因子(IL- 4、IL- 5、IL-13)在過敏性哮喘中有重要作用。而Th1型免疫反應(yīng)減弱也是過敏性哮喘發(fā)生的重要因素，適量的Th1細(xì)胞相關(guān)因子IFN-γ可以抑制T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，因此適當(dāng)提高Th1型細(xì)胞反應(yīng)可負(fù)向調(diào)節(jié)過敏性哮喘的進(jìn)展[10]。目前有學(xué)者根據(jù)過敏性哮喘的具體分子機(jī)制將哮喘分為不同的內(nèi)生型，在此基礎(chǔ)上，隨著新型生物療法的發(fā)展，傳統(tǒng)哮喘治療無效的患者可以給予抗lgE、抗IL- 5、抗IL- 4/IL-13等新型生物藥物控制哮喘癥狀，改善病情[11-13]。生物分子靶向治療可較好的控制病情，不過由于費(fèi)用較高，在臨床應(yīng)用中受到一定限制[12]。

GLP-1是一種代謝激素，由小腸L細(xì)分泌，可與廣泛分布的受體(GLP-1R)相互作用，觸發(fā)胰島素產(chǎn)生、葡萄糖攝取、食欲下降等[14]。GLP-1R在肺中表達(dá)豐富，可刺激血管擴(kuò)張、表面活性劑的產(chǎn)生和支氣管擴(kuò)張。近年來研究發(fā)現(xiàn)GLP-1類似物利拉魯肽可以改善肥胖相關(guān)哮喘的病情[15]。GLP-1R激動劑可作為一種臨床應(yīng)用安全，實(shí)驗(yàn)室和臨床研究均可立即使用的藥物。將來通過進(jìn)一步研究，GLP-1R激動劑或許可作為一種所謂的新型藥物，用于治療哮喘、肥胖和糖尿病合并患者[16]。

本研究應(yīng)用GLP-1類似物利拉魯肽干預(yù)由屋塵螨誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型，發(fā)現(xiàn)GLP-1類似物能夠顯著抑制小鼠過敏性氣道炎癥，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。GLP-1干預(yù)的小鼠過敏性哮喘模型組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞較HDM組顯著減少，嗜酸性粒細(xì)胞及2型巨噬細(xì)胞在T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化中有重要作用[17-18]。為進(jìn)一步研究GLP-1抑制氣道過敏性炎癥的機(jī)制，本研究在顯微鏡下摘取支氣管肺門淋巴結(jié)，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測其中CD4/CD8+IFN-γ+及CD4/CD8+IL- 4+比例，發(fā)現(xiàn)支氣管肺門淋巴結(jié)中CD4/CD8+IL- 4+細(xì)胞比例降低，而CD4/CD8+IFN-γ+細(xì)胞比例升高，調(diào)整了Th1/Th2細(xì)胞平衡。有學(xué)者提出過敏性哮喘主要與CD4+Th2細(xì)胞有關(guān)，而本研究發(fā)現(xiàn)在HDM誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型中，CD8+IL- 4+細(xì)胞也呈現(xiàn)顯著增高，其在過敏性哮喘中可能有重要作用；同時用GLP-1干預(yù)的小鼠哮喘模型組，CD8+IFN-γ+比例較模型組顯著升高，CD8+IL- 4+細(xì)胞比例有一定的下降。進(jìn)一步用ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子水平，結(jié)果與Th細(xì)胞變化一致，GLP-1類似物干預(yù)可以降低Th2型炎癥因子水平。本研究證實(shí)GLP-1在HDM誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型中可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化，促進(jìn)Th1/Th2細(xì)胞再平衡，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

本研究證實(shí)GLP-1能抑制HDM所致過敏性氣道炎癥，其可能通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞向Th1/Th2細(xì)胞分化再平衡發(fā)揮作用，為過敏性哮喘患者提供了新的治療思路及理論依據(jù)，尤其可為糖尿病合并過敏性哮喘患者提供理想的治療手段。