李泰階，蔣誠(chéng)傳，林青

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，南寧 530199)

磷霉素是一種由鏈霉菌屬合成的天然抗生素，具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，化學(xué)名為(1R，2S)-1，2-環(huán)氧順丙烯磷酸。磷霉素口服30%～40%可由胃腸道吸收，且不受食物的影響，2～4 h血藥濃度達(dá)到峰值。其不與血漿蛋白進(jìn)行結(jié)合，半衰期為1.5～2.0 h。磷霉素進(jìn)入人體后組織分布廣，以腎組織中濃度最高，其次為心、肺、肝等器官組織。磷霉素對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌有較好的抗菌活性。近年來(lái)，磷霉素因其特殊的殺菌機(jī)制和理化性質(zhì)、無(wú)交叉耐藥、抗菌活性強(qiáng)、組織分布廣泛、聯(lián)合用藥時(shí)呈現(xiàn)協(xié)同殺菌作用等優(yōu)點(diǎn)，重新進(jìn)入臨床并在治療多重耐藥菌引起的感染中發(fā)揮重要作用[1]。隨著磷霉素耐藥性的增加，分析并研究磷霉素的耐藥機(jī)制，減緩耐藥性產(chǎn)生，延長(zhǎng)其臨床使用壽命具有重要意義[2]?，F(xiàn)對(duì)磷霉素細(xì)菌耐藥機(jī)制進(jìn)行闡述，以為磷霉素臨床合理使用、減緩其耐藥性的產(chǎn)生和傳播及開發(fā)新型抗菌藥物提供新思路。

1 磷霉素的發(fā)現(xiàn)與分子結(jié)構(gòu)

磷霉素是一種廣譜抗菌藥物，于1969年由西班牙CEP公司和美國(guó)MERCK公司在鏈霉菌發(fā)酵液中首次發(fā)現(xiàn)[3]。磷霉素是一種天然抗生素，雖然部分菌種可產(chǎn)生磷霉素，但其產(chǎn)量普遍偏低。2006年，美國(guó)伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校的一個(gè)科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)分子克隆技術(shù)成功獲得磷霉素生物合成基因工程菌株，至此磷霉素的產(chǎn)量得到大幅提升[4]。磷霉素是一種磷酸衍生物，分子量極低，幾乎不與蛋白質(zhì)結(jié)合。磷霉素是一種獨(dú)特的抗菌藥物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與現(xiàn)有的抗生素差別較大。磷霉素的分子結(jié)構(gòu)在不同藥物劑型也存在一定差異。其有兩種口服劑型：磷霉素鈣(C3H5CaO4P)和磷霉素氨丁三醇(C3H7O4P·C4H11NO3)；一種靜脈注射劑型：磷霉素二鈉(C3H5Na2O4P)[5]。

2 磷霉素的抗菌機(jī)制與抗菌活性

磷霉素對(duì)細(xì)菌的抗菌活性主要通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成中的第一步酶催化反應(yīng)，干擾肽聚糖前體二磷酸尿苷-N-乙酰胞壁酸的形成。MurA(UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase)通過(guò)催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移到二磷酸尿苷-N-乙酰葡糖胺的3′-OH端而參與肽聚糖生物合成，這是合成肽聚糖的第一個(gè)重要步驟。磷霉素是磷酸烯醇式丙酮酸的類似物，因此能代替磷酸烯醇式丙酮酸與MurA活性中心半胱氨酸的巰基進(jìn)行不可逆的共價(jià)結(jié)合，使MurA失活；進(jìn)而抑制二磷酸尿苷-N-乙酰氨基葡萄糖-烯丙基丙酮酸的生物合成，使細(xì)菌細(xì)胞壁的合成停滯，從而發(fā)揮殺菌作用[6]。在鳥嘌呤和胞嘧啶百分比含量較低的革蘭陽(yáng)性菌中存在兩種“murA”基因(murA和murZ)，其基因產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上非常相似。在肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌中，兩個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物均能維持肽聚糖的合成，MurA和MurZ兩種同工酶對(duì)磷霉素均很敏感[7]。

磷霉素主要在細(xì)菌的生長(zhǎng)階段發(fā)揮作用。細(xì)菌需要N-乙酰胞壁酸合成肽聚糖，而磷霉素可干擾肽聚糖的合成，因此磷霉素對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌具有廣泛的活性。但少數(shù)細(xì)菌，如頭狀葡萄球菌、腐生葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、結(jié)核分枝桿菌和沙眼衣原體等對(duì)磷霉素天然耐藥。因磷霉素獨(dú)特的殺菌機(jī)制、較好的抗菌活性，不易與其他抗菌藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，其已廣泛應(yīng)用于多重耐藥菌感染的治療，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬(wàn)古霉素腸球菌、耐青霉素肺炎鏈球菌、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌、產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌和耐碳青霉烯銅綠假單胞菌等[8]。

3 磷霉素的耐藥機(jī)制

隨著磷霉素在臨床的廣泛使用，細(xì)菌對(duì)其耐藥率逐漸顯現(xiàn)。細(xì)菌對(duì)磷霉素的耐藥機(jī)制主要包括五大類：①磷霉素靶酶MurA的突變及過(guò)表達(dá)；②磷霉素?cái)z取減少；③磷霉素修飾酶表達(dá)；④磷霉素外排泵機(jī)制；⑤磷霉素異質(zhì)性耐藥。

3.1磷霉素靶酶MurA突變及過(guò)表達(dá) 磷霉素靶酶MurA活性位點(diǎn)特別是磷霉素結(jié)合位點(diǎn)的突變，包括周邊氨基酸替換，均可導(dǎo)致MurA對(duì)磷霉素的結(jié)合減少，使細(xì)菌對(duì)磷霉素出現(xiàn)耐藥。MurA氨基酸序列第115位半胱氨酸的巰基與磷霉素發(fā)生不可逆的共價(jià)結(jié)合后，MurA失活。當(dāng)MurA氨基酸序列第115位半胱氨酸突變成天冬氨酸后，MurA失去與磷霉素結(jié)合能力；磷霉素不能阻斷細(xì)菌壁的合成，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥[9]。MurA氨基酸序列中其他位置發(fā)生突變也可導(dǎo)致其與磷霉素?zé)o法結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，MurA的第369位(Asp369→Asn369)和370位(Leu370→Ile370)氨基酸發(fā)生突變，可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥[10]。此外，MurA過(guò)表達(dá)也可導(dǎo)細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥。當(dāng)誘導(dǎo)MurA過(guò)表達(dá)后，大腸埃希菌對(duì)磷霉素表現(xiàn)出耐藥[11]。murA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)可導(dǎo)致產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌對(duì)磷霉素耐藥[12]。對(duì)磷霉素耐藥的腸球菌的研究顯示，部分菌株MurA的氨基酸序列發(fā)生多個(gè)氨基酸替換；部分腸球菌攜帶fosB；部分腸球菌高水平表達(dá)fosX[13]。

3.2磷霉素?cái)z取減少 磷霉素需要借助轉(zhuǎn)運(yùn)攝取系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮抗菌活性。當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)攝取系統(tǒng)編碼基因發(fā)生堿基缺失或突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能缺失時(shí)，細(xì)菌無(wú)法將磷霉素運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)而導(dǎo)致耐藥。細(xì)菌對(duì)磷霉素轉(zhuǎn)運(yùn)主要依賴葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(glucose-6-phosphate transporter，UhpT)和甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(glycerol-3-phosphate transporter，GlpT)。其中，GlpT屬于MFS(major facilitator superfamily)超家族外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；有12個(gè)跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)膜蛋白，主要轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)成分和各種離子[14]。uhpT表達(dá)需要外源性6-磷酸葡萄糖的誘導(dǎo)，而glpT可在不依賴6-磷酸葡萄糖的條件下在細(xì)菌體內(nèi)持續(xù)表達(dá)。UhpT和GlpT的編碼基因均由染色體編碼；染色體編碼基因及其調(diào)控基因發(fā)生突變均可導(dǎo)致磷霉素轉(zhuǎn)運(yùn)攝取減少，最終導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥[15]。Takahata等[10]對(duì)臨床分離的磷霉素耐藥大腸埃希菌murA、uhpT、glpT進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌GlpT氨基酸序列發(fā)生替換，并與甘油-3-磷酸及磷霉素的攝取減少密切相關(guān)；glpT的C端發(fā)生基因片段的插入或丟失，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥；部分大腸埃希菌uhpT出現(xiàn)丟失。Nilsson等[16]在研究大腸埃希菌對(duì)磷霉素的耐藥機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，uhpT和glpT均出現(xiàn)基因突變、重復(fù)序列、插入序列；同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)，uhpT和glpT在體內(nèi)和體外的突變率存在顯著差異。

UhpT或GlpT的調(diào)控基因包括uhpA、cyaA和ptsI，其編碼的調(diào)控蛋白分別為UhpA、CyaA和PtsI。UhpA促進(jìn)UhpT的表達(dá)；uhpA編碼uhpT啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄激活所需的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)uhpA發(fā)生堿基缺失或突變時(shí)可抑制uhpT的表達(dá)[17]。glpT的表達(dá)受環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)-受體蛋白復(fù)合物的調(diào)控。當(dāng)cAMP-受體蛋白復(fù)合物結(jié)合到glpT的特異性啟動(dòng)子位點(diǎn)后促進(jìn)其表達(dá)；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)cAMP表達(dá)下降可導(dǎo)致glpT表達(dá)下調(diào)[18]。PtsI和CyaA參與細(xì)菌體內(nèi)cAMP的合成。ptsI和cyaA的突變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低，下調(diào)GlpT和UhpT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，從而減少細(xì)菌對(duì)磷霉素的攝取，使細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥[19-20]。

3.3磷霉素修飾酶表達(dá) 多種修飾酶可通過(guò)共價(jià)修飾裂解磷霉素的環(huán)氧化物部分的碳氧鍵使其失活。目前已發(fā)現(xiàn)的修飾酶可分為金屬酶(包括FosA、FosB、FosC和FosX等)和激酶(包括FomA和FomB)。其中，金屬酶通過(guò)添加各種底物打開環(huán)氧化物環(huán)使磷霉素失活[21]。激酶主要通過(guò)磷酸化使磷霉素失活。

FosA是一種谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，以Mn2+和K+作為輔因子，其通過(guò)催化谷胱甘肽添加到磷霉素的C1位置，破壞環(huán)氧化物環(huán)[22]。fosA最早被發(fā)現(xiàn)存在于黏質(zhì)沙雷菌的質(zhì)粒TN2921轉(zhuǎn)座子上。fosA主要存在于腸桿菌科、假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬中[23]。而其他質(zhì)粒攜帶的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，如fosA2、fosA3、fosA5和fosA6也相繼被發(fā)現(xiàn)[10，24]。FosA2與FosA在氨基酸序列上具有95%的同源性[25]。fosA5編碼含139個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)酶；FosA5在氨基酸序列上與FosA、FosA2、FosA3和FosA4有69%～80%的同源性[26]。fosA常與其他耐藥基因共存于同一質(zhì)粒，如gyrA、parC、parE、CTX-M、floR、dfrA7、sul1、sul2、aadA5、aphA6、mphA、KPC、NDM；導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素、氨基糖苷類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類等抗菌藥物產(chǎn)生共同耐藥[27]。

目前，我國(guó)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)磷霉素的耐藥機(jī)制主要由fosA3介導(dǎo)[28]。有文獻(xiàn)報(bào)道，7.8%的大腸埃希菌對(duì)磷霉素不敏感，其中80%的菌株攜帶fosA3；42%菌株攜帶的fosA3可通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移[29]。另一項(xiàng)研究顯示，在產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌中，60.8%的菌株對(duì)磷霉素耐藥；在優(yōu)勢(shì)克隆菌株中，fosA3和blaKPC-2位于同一個(gè)質(zhì)粒上[30]。在日本分離的一株大腸埃希菌，fosA3與CTX-M位于同一質(zhì)粒上[31]。

FosB是一種Mg2+依賴的L-半胱氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶，其氨基酸序列與FosA有48%的同源性[32]。FosB主要由革蘭陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生，包括枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌等[33]。這些細(xì)菌不產(chǎn)生谷胱甘肽，但使用桿菌硫醇作為供體。金黃色葡萄球菌的fosB由染色體編碼，其與磷霉素的活性相關(guān)。金黃色葡萄球菌因fosB或桿菌硫醇合成機(jī)制的缺失大大增加了其對(duì)磷霉素的敏感性[34]。

FosC最早分離自產(chǎn)磷霉素的丁香假單胞菌PB-5123菌株中[35]。該蛋白酶由182個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為19 000。FosC使用ATP作為底物向磷霉素添加磷酸基團(tuán)使磷霉素失去活性；該反應(yīng)可以被堿性磷酸酶逆轉(zhuǎn)。Wachino等[36]在研究CTX-M型大腸埃希菌對(duì)磷霉素耐藥性時(shí)首次發(fā)現(xiàn)FosC2。FosC2是FosC亞型，由132個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列與木糖氧化無(wú)色桿菌中分離的FosC具有72%的同源性[36]。FosC2可通過(guò)發(fā)揮谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性使磷霉素失活。

FosX是一種水解酶，與FosA和FosB具有30%～35%的序列同源性[37]；但它是一種依賴于Mn2+的環(huán)氧化物水解酶，以水為底物，通過(guò)在磷霉素C1位置添加羥基并打開其環(huán)氧化物環(huán)使磷霉素失活。FosX 酶存在于單核細(xì)胞增生李斯特菌、肉毒梭菌和布魯菌中[38]。

FomA和FomB是分離自產(chǎn)磷霉素細(xì)菌(如威德摩爾鏈霉菌和弗雷德氏鏈霉菌)的一種激酶；并被證實(shí)通過(guò)磷酸化使磷霉素失活，阻止磷霉素的殺菌活性[39]。其中，F(xiàn)omA催化磷霉素磷酸基團(tuán)磷酸化為磷霉素單磷酸；FomB將磷霉素單磷酸轉(zhuǎn)化為磷霉素二磷酸。上述兩個(gè)化學(xué)反應(yīng)均由ATP和Mg2+催化[40]。

3.4磷霉素外排泵機(jī)制 目前，關(guān)于外排泵機(jī)制導(dǎo)致磷霉素耐藥的研究較少，僅見Tet38外排泵。Tet38外排泵是金黃色葡萄球菌染色體編碼的MFS超家族外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有14個(gè)跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域，其底物包括多種化合物[41]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，質(zhì)粒過(guò)表達(dá)tet38和glpT突變體的金黃色葡萄球菌對(duì)磷霉素最低抑菌濃度增加，同時(shí)細(xì)菌體內(nèi)磷霉素含量降低，并受甘油-3-磷酸影響。當(dāng)Tet38外排泵發(fā)生基因突變可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素最低抑菌濃度降低，菌體內(nèi)磷霉素濃度升高，說(shuō)明Tet38是磷霉素的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[42]。Xu等[43]通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)磷霉素耐藥的金黃色葡萄球菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨著磷霉素濃度的增加，耐藥菌tet38表達(dá)量增加。

3.5磷霉素異質(zhì)性耐藥 細(xì)菌異質(zhì)性耐藥是指分離菌株中含有細(xì)胞亞群，與主要群體相比，這些細(xì)菌亞群對(duì)抗生素的敏感性顯著降低[44]。目前，磷霉素的異質(zhì)性耐藥研究主要集中于肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肺炎鏈球菌對(duì)磷霉素可產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥且同時(shí)表達(dá)MurA；當(dāng)敲除murA后，耐藥菌株的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象消失[45]。與非異質(zhì)性耐藥菌株的不同，異質(zhì)性耐藥菌株MurA(Ala364→Thr364)中的單個(gè)氨基酸發(fā)生突變；當(dāng)將突變murA導(dǎo)入無(wú)異質(zhì)性耐藥菌株后，其異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象并未出現(xiàn)，推測(cè)異質(zhì)性耐藥的原因是由多種機(jī)制共同導(dǎo)致。一項(xiàng)針對(duì)銅綠假單胞菌的研究，通過(guò)菌群譜分析法實(shí)驗(yàn)證實(shí)所有測(cè)試的銅綠假單胞菌中均存在異質(zhì)性耐藥；時(shí)間殺菌實(shí)驗(yàn)顯示，采用不同濃度的磷霉素處理后均可導(dǎo)致對(duì)磷霉素敏感的菌株完全被磷霉素耐藥菌株所取代[46]。

4 小 結(jié)

細(xì)菌對(duì)磷霉素的耐藥可以通過(guò)MurA的突變及過(guò)表達(dá)、磷霉素?cái)z取減少、修飾酶表達(dá)、外排泵機(jī)制和異質(zhì)性耐藥等機(jī)制單獨(dú)或聯(lián)合發(fā)揮作用。重新回歸臨床的磷霉素，不僅具有廣譜抗菌效果，同時(shí)具有良好的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)，對(duì)多重耐藥菌株仍具有較高的敏感性。當(dāng)前，全球面臨多重耐藥菌抗感染與治療的重大挑戰(zhàn)，因此如何能夠減緩部分安全經(jīng)濟(jì)的經(jīng)典抗菌藥物(磷霉素等)耐藥性的產(chǎn)生和耐藥傳播的速度具有重要意義。未來(lái)，深入研究磷霉素的耐藥機(jī)制、傳播機(jī)制以及制訂合理的用藥方案將為臨床治療多重耐藥菌引起的感染提供廣闊的應(yīng)用前景。