楊仁生，龐榮清

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500)

燙傷是指由沸水、蒸汽等熱力所致的組織器官損傷，是常見且復(fù)雜的創(chuàng)傷疾病之一[1]，是嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問題[2]。燙傷可損傷皮膚，嚴(yán)重燙傷往往引發(fā)機(jī)體全身炎癥反應(yīng)，甚至因多器官功能障礙綜合征(multi-organ dysfunction syndrome，MODS)而導(dǎo)致死亡[3]。目前，嚴(yán)重燙傷的主要治療策略是抗休克治療、抗感染治療、皮膚創(chuàng)面修復(fù)治療以及維持器官功能的對癥支持治療[4]，但療效不佳。一方面，這些治療方法在皮膚修復(fù)中難以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)闆]有合適的皮膚可以移植，且難以保證移植成功[5]；另一方面，這些治療方法與嚴(yán)重燙傷后的病理生理變化相互矛盾[6]。而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展為嚴(yán)重燙傷治療帶來新的希望[7-10]。因此，研究探索MSC調(diào)節(jié)嚴(yán)重燙傷引發(fā)的免疫功能紊亂[10]、修復(fù)皮膚創(chuàng)面[5]和組織[11]的技術(shù)方法及其作用機(jī)制顯得十分緊迫?，F(xiàn)就MSC治療嚴(yán)重燙傷的研究進(jìn)展予以綜述，通過分析燙傷模型的選擇與MSC治療結(jié)合綜合考慮研究方案的必要性，展望借助高通量技術(shù)方法深入開展MSC治療嚴(yán)重燙傷系列研究的前景。

1 燙傷MODS的病理生理機(jī)制

皮膚由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成，包括血管、毛囊和汗腺等附屬物[12]，是機(jī)體將外部環(huán)境與內(nèi)部器官分開的重要屏障。當(dāng)皮膚受到嚴(yán)重燙傷后，一方面，熱力效應(yīng)直接破壞皮膚組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致組織滲透性增加，大量液體滲出，循環(huán)血量明顯減少，引起器官組織缺血缺氧，導(dǎo)致肺、肝等主要器官的功能障礙和損害[13]；同時，嚴(yán)重燙傷會引起全身應(yīng)激性反應(yīng)，尤其是胃腸道的應(yīng)激性損傷，造成黏膜組織細(xì)胞的變性、壞死、脫落，直接破壞胃腸道黏膜屏障功能[14]，微生物趁機(jī)移位進(jìn)入血液循環(huán)，形成腸源性的內(nèi)毒素血癥[15]。腸源性的內(nèi)毒素血癥是嚴(yán)重燙傷后導(dǎo)致多器官功能衰竭的重要原因之一。另一方面，大面積燙傷后，若不進(jìn)行手術(shù)治療，創(chuàng)面持續(xù)存在，殘留的壞死組織及大量滲液為皮膚表面的大量微生物異常生長提供了良好條件，當(dāng)創(chuàng)面上的微生物達(dá)到一定濃度時，微生物趁機(jī)侵襲機(jī)體焦痂深層，并不斷侵襲鄰近的健康組織，導(dǎo)致嚴(yán)重外源性感染[16]?？梢?，嚴(yán)重燙傷本質(zhì)上是局部直接組織損傷并發(fā)遠(yuǎn)端多器官組織炎性損傷。其主要病理生理機(jī)制是毛細(xì)血管網(wǎng)通透性增加，激活機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)[17]，釋放大量應(yīng)激激素和炎癥介質(zhì)，逐步發(fā)展為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”或“瀑布效應(yīng)”[18-19]。在此基礎(chǔ)上，內(nèi)外源性感染發(fā)生，微生物及其細(xì)菌毒素進(jìn)入血液循環(huán)形成菌血癥或膿毒癥，機(jī)體在兩次打擊下極易引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至發(fā)展為MODS[3]。

由此可見，機(jī)體受到嚴(yán)重燙傷后，從皮膚損傷到MODS是一個不斷發(fā)展演變遞進(jìn)的過程。研究觀察嚴(yán)重燙傷后的病理生理發(fā)展變化規(guī)律，針對關(guān)鍵發(fā)展環(huán)節(jié)，探索延緩或阻斷某個關(guān)鍵環(huán)節(jié)的發(fā)展進(jìn)程，最大限度地減輕、延緩或阻止嚴(yán)重燙傷后引起的免疫功能紊亂、緩解臟器功能損傷，有可能降低以MODS為病理生理特征的急危重癥患者的死亡率。因此，從燙傷引起的MODS發(fā)病機(jī)制出發(fā)，以某個關(guān)鍵發(fā)展環(huán)節(jié)為切入點(diǎn)，深入探討嚴(yán)重燙傷的干細(xì)胞治療策略具有非常重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價值[20-21]。

2 MSC在嚴(yán)重燙傷治療中的應(yīng)用

MSC是一類起源于中胚層，具有自我更新和多向分化潛能的不成熟細(xì)胞，可以從骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等器官或組織中分離獲取[22]。眾多干細(xì)胞生物學(xué)研究證實(shí)，MSC不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ、CD40和CD80等共刺激分子[12,23-24]，即MSC具有低免疫原性，可以異體甚至異種移植用于臨床治療。MSC可抑制淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)[25]，直接抑制淋巴細(xì)胞增殖，還可分泌多種活性因子參與免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)[26]，從而減輕炎癥反應(yīng)，避免了由糖皮質(zhì)激素抗炎治療引發(fā)的機(jī)體免疫功能紊亂和抗生素治療導(dǎo)致的機(jī)體腸道菌群的異位和失調(diào)，從而加重機(jī)體的感染；同時MSC還具有歸巢和分化功能，促進(jìn)皮膚組織和臟器組織修復(fù)，從而恢復(fù)臟器功能[27]。MSC的這些獨(dú)特生物學(xué)特性使得異體移植MSC治療嚴(yán)重燙傷成為可能。

2.1基于全身免疫調(diào)節(jié)的MSC治療 雖然MSC對機(jī)體燙傷的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚，但目前普遍認(rèn)為MSC主要依賴于細(xì)胞與細(xì)胞間的直接接觸或旁分泌免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)兩種方式來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，MSC可使巨噬細(xì)胞從炎癥的M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)樾迯?fù)性抗炎M2表型[4,7-8]，使傷口產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-10][7]，減少促炎性細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子-α)[9]。另一研究也顯示，MSC治療燙傷模型可以持續(xù)減少炎癥細(xì)胞因子(高遷移率族蛋白B1、IL-6和腫瘤壞死因子-α)的生成，而增加抗炎性細(xì)胞因子(IL-10)的生成[10]。說明MSC至少具有通過以IL-10為核心的平衡途徑正向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷微環(huán)境中，促炎性細(xì)胞因子可以刺激MSC分泌一氧化氮、前列腺素E2和吲哚胺2,3-雙加氧酶等介質(zhì)[28]，通過影響免疫細(xì)胞的增殖及分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，如轉(zhuǎn)化生長因子-β和前列腺素E2可抑制T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，抑制輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th細(xì)胞)0分化為Th1細(xì)胞，促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制自然殺傷細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等促炎免疫細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等抗炎免疫細(xì)胞的增加[12,29-30]。MSC的這些調(diào)節(jié)作用中有一個重要的作用機(jī)制是可以調(diào)節(jié)p38促分裂原活化的蛋白激酶和核因子κB P65 蛋白的磷酸化水平，在燙傷中可激活肝臟庫普弗細(xì)胞，MSC可以在嚴(yán)重燙傷下通過分泌腫瘤壞死因子-α刺激基因6，從而減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)[10]。

根據(jù)嚴(yán)重燙傷的病理生理進(jìn)展，結(jié)合MSC生物學(xué)功能方面的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用MSC的免疫調(diào)節(jié)功能治療嚴(yán)重燙傷是可行的，但目前的研究主要表明MSC治療起到了調(diào)節(jié)免疫功能的作用，并揭示了部分作用機(jī)制，迫切需要在掌握嚴(yán)重燙傷后病理生理發(fā)展變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步廣泛研究MSC的免疫調(diào)節(jié)作用及其更全面的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，尤其應(yīng)該注意負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制研究。以此為切入點(diǎn)，從免疫調(diào)節(jié)療效角度深入探索MSC的體外預(yù)處理方案以及細(xì)胞治療的時機(jī)和細(xì)胞治療劑量對燙傷治療的影響，有望最大限度地糾正嚴(yán)重燙傷后免疫功能失衡。這可以在一定程度上延緩或阻止機(jī)體全身炎癥反應(yīng)甚至預(yù)防MODS的發(fā)生，從而降低嚴(yán)重燙傷患者的死亡率[31]。

2.2基于外泌體的MSC治療 MSC除了分泌多種活性因子及介質(zhì)外，還能分泌外泌體發(fā)揮生物學(xué)作用。外泌體是一種由真核細(xì)胞的多泡體與胞膜融合后釋放到胞外的納米級膜性小囊泡[32]，其作為信號分子載體，可以在不同細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞及細(xì)胞大分子間的傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展，將生物分子傳遞到受體細(xì)胞發(fā)揮多種生物學(xué)功能[33]。MSC能夠通過外泌體將巨噬細(xì)胞暴露于微RNA來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，這些RNA結(jié)合到免疫細(xì)胞中并抑制促炎性細(xì)胞因子的分泌。然后通過免疫細(xì)胞之間的這些微RNA的交換來傳遞信息，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[34]。同時，MSC來源的外泌體還可以促進(jìn)傷口的血管生成素2上調(diào)，進(jìn)而增強(qiáng)損傷區(qū)域血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、成管能力，從而促進(jìn)血管生成，加快傷口愈合[35]。MSC的免疫調(diào)節(jié)作用與分化修復(fù)作用并不是孤立存在的，如MSC釋放的外泌體除了促進(jìn)血管生成，還可通過極化M2型巨噬細(xì)胞來減輕黏膜炎癥，維持小鼠腸道結(jié)構(gòu)的完整性[36]?？梢?，外泌體是MSC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的延伸。外泌體遠(yuǎn)小于MSC，大劑量使用不會導(dǎo)致肺栓塞，更重要的是可以制成注射液，目前已經(jīng)有外泌體直接注射、靜脈注射、腹膜內(nèi)注射、口服給藥和基于水凝膠的包埋研究，已經(jīng)被用來治療不同的疾病模型[37]。在戰(zhàn)爭條件下，燃燒彈、火焰噴射器等武器的使用更易集中出現(xiàn)大量嚴(yán)重傷病員，MSC來源的外泌體注射液的成功開發(fā)，使得野戰(zhàn)條件下使用成為可能。

2.3基于組織修復(fù)的MSC治療 MSC治療嚴(yán)重燙傷的另一個重要機(jī)制是干細(xì)胞的分化和修復(fù)功能?；A(chǔ)研究表明，移植進(jìn)入體內(nèi)的MSC可以在趨化因子的引導(dǎo)下靶向遷移到燙傷創(chuàng)面及機(jī)體組織中定植，在特定微環(huán)境條件下分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞，如皮膚細(xì)胞等[2,38]。有研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)MSC靶向遷移的是炎癥組織中的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1，呈梯度分布的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1會引導(dǎo)更多的MSC向受損部位遷移[9,12]，并分化為功能組織細(xì)胞以替代受損細(xì)胞[12]。MSC可通過旁分泌機(jī)制分泌多種生長因子和誘導(dǎo)因子，激活機(jī)體原位干細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)傷口快速愈合[9]。同時，MSC還可分泌乳酸鹽，使巨噬細(xì)胞極化轉(zhuǎn)變?yōu)樾迯?fù)性抗炎M2型巨噬細(xì)胞，從而增加抵抗素樣分子α和整合素(CD11b)的表達(dá)，其中抵抗素樣分子α可抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)展，促進(jìn)新生血管的生成和成肌纖維細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)傷口的愈合[39]；CD11b可誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)，通過多途徑調(diào)節(jié)傷口炎癥反應(yīng)，并通過抑制T細(xì)胞增殖抑制長時間炎癥引起的皮膚纖維化[40]，從而抵御外界病原微生物的侵入，預(yù)防炎癥進(jìn)一步加重。此外，MSC還廣泛參與腸[36]、肺[41]和肝[25]等器官損傷修復(fù)，并通過修復(fù)組織器官緩解內(nèi)源性感染，促進(jìn)皮膚愈合預(yù)防外源性細(xì)菌侵入機(jī)體進(jìn)一步加重全身炎癥反應(yīng)。因此，開展MSC修復(fù)嚴(yán)重燙傷組織研究，需要復(fù)制不同損傷程度的模型，并開展不同途徑的細(xì)胞給藥比較研究。

3 基于MSC治療需求的燙傷動物模型選擇

從上述分析可知，開展MSC治療燙傷研究必須首先建立一個穩(wěn)定、規(guī)范化、符合臨床要求的燙傷動物模型。從實(shí)驗(yàn)動物的特點(diǎn)來看，豬的皮膚組織結(jié)構(gòu)和生化指標(biāo)與人極其相似[1，20]，體型大小也更適于皮膚移植的手術(shù)操作，但實(shí)驗(yàn)成本相對較高，且難以大批量復(fù)制模型用于細(xì)胞劑量篩選等研究。小鼠個體太小，血管太細(xì)，而MSC直徑較大，當(dāng)靜脈輸注MSC進(jìn)入血管時，細(xì)胞數(shù)量稍多易造成梗死，不太適于開展MSC靜脈輸注治療研究。因此，燙傷動物模型最常用大鼠和兔[42-44]。

從MSC治療實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來看，利用金屬棒[45-48]直接接觸動物皮膚造成局部皮膚不同程度損傷的方法簡便易行，容易精準(zhǔn)控制燙傷作用時間、創(chuàng)面形狀和面積，便于批量復(fù)制燙傷動物模型，但因?yàn)榻饘贍C頭與皮膚之間容易導(dǎo)致致傷壓力不均、局部高溫容易造成表皮凝固性壞死而不利于熱力效應(yīng)向深層傳播、金屬燙頭容易快速降溫，故這類局部燙傷的動物模型均一性不好，不易誘發(fā)全身應(yīng)急性損傷，較適于小樣本局部皮膚創(chuàng)面修復(fù)的治療觀察研究。直接接觸熱水致傷的方法[29，39]容易控制水溫，但不好控制燙傷皮膚的形狀和面積，且水溫最高100 ℃，易導(dǎo)致表皮凝固性壞死，不利于熱力效應(yīng)向深層傳播，同樣相對不易誘發(fā)全身應(yīng)急性損傷。而蒸汽溫度遠(yuǎn)超100 ℃，即便在海拔1 890 m的昆明地區(qū)也可高達(dá)110 ℃，且熱力效應(yīng)穿透力極強(qiáng)，蒸汽作用時間極易精準(zhǔn)控制，特別容易造成大面積皮膚深度損傷，如果輔以特定的蒸汽產(chǎn)生裝置和特定的皮膚保護(hù)模具[7]，很容易短時間內(nèi)批量制備不同創(chuàng)面大小或不同燙傷程度的均一燙傷模型，很容易誘發(fā)局部組織變性壞死和全身性炎癥反應(yīng)，特別適于開展局部皮膚組織MSC修復(fù)治療、MSC系統(tǒng)性預(yù)防和治療效果評價以及治療機(jī)制研究，同時獲得的模型也可用于研究觀察MSC生存演變規(guī)律。

回顧MSC治療燙傷的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不同實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果不適合進(jìn)行比較，因?yàn)橹谱鳡C傷模型差異較大，如熱水致傷大鼠模型水溫差異太大，故動物模型病理生理變化差異也很大。因此，在開展MSC治療燙傷研究時，應(yīng)充分考慮不同制備方法獲得的燙傷動物模型的病理生理變化特點(diǎn)、將動物模型制備與MSC治療方案結(jié)合起來綜合考慮設(shè)計(jì)研究方案，如研究MSC預(yù)防或治療嚴(yán)重燙傷引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)時，只有選擇蒸汽致傷這類致傷嚴(yán)重的模型，才能模擬從皮膚損傷到MODS的過程，也才能探索延緩或者阻斷某個關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)展進(jìn)程的切入點(diǎn)，在構(gòu)思科研立項(xiàng)時，才能找準(zhǔn)需要解決的科學(xué)問題，也才更有利于從不同角度深入推進(jìn)MSC治療嚴(yán)重燙傷的系列研究。事實(shí)上，目前MSC治療燙傷的研究，最需要的就是基于從皮膚損傷到MODS的動態(tài)發(fā)展變化規(guī)律的認(rèn)識、借助各種高通量檢測分析技術(shù)手段開展的非現(xiàn)象觀察的深層次研究，有望理清嚴(yán)重燙傷引發(fā)的免疫功能紊亂以及MSC調(diào)節(jié)的十分復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制和因果關(guān)系，以為將來臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4 小 結(jié)

MSC在嚴(yán)重燙傷中發(fā)揮重要作用，可以利用其生物學(xué)功能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)面血管新生、促進(jìn)創(chuàng)面愈合。鑒于目前嚴(yán)重燙傷的治療效果尚不滿意的現(xiàn)狀，結(jié)合嚴(yán)重燙傷的病理生理變化特點(diǎn)，充分運(yùn)用MSC基礎(chǔ)研究的最新成果，建立合適的動物模型研究開發(fā)嚴(yán)重燙傷等以MODS為病理生理特征的急危重癥治療新技術(shù)具有重要意義。但是MSC的輸入途徑、劑量、時間仍需要明確，未來應(yīng)進(jìn)一步了解MSC的功能及其機(jī)制，以為臨床治療嚴(yán)重燙傷提供理論依據(jù)。