邱敏，陳柳，代解杰

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118)

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，乳腺癌即是常見惡性腫瘤之一[1]。乳腺癌是發(fā)生于乳腺上皮或?qū)Ч苌掀さ膼盒阅[瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。培養(yǎng)乳腺腫瘤細(xì)胞對于研究各種致病因素導(dǎo)致的乳腺病理改變以及乳腺腫瘤藥物研發(fā)等均具有重要意義[2-3]。目前研究者已從人、小鼠、大鼠、犬等不同物種中分離出乳腺癌原代細(xì)胞，且建立了乳腺癌細(xì)胞系，通常從人體中分離的腫瘤細(xì)胞較從動物中分離的腫瘤細(xì)胞對于個(gè)體化的腫瘤治療更有利，但在篩選白血病藥物時(shí)，小鼠白血病細(xì)胞系是最好的，因此動物腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)也非常重要[4]。分離培養(yǎng)實(shí)體腫瘤細(xì)胞是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，需要專門的技術(shù)。乳腺癌原代細(xì)胞培養(yǎng)在乳腺癌研究中占據(jù)重要地位，但不同物種、個(gè)體以及病理類型細(xì)胞培養(yǎng)的成功率存在較大差異，因此其廣泛應(yīng)用受到限制；同時(shí)，乳腺腫瘤細(xì)胞也存在諸多優(yōu)點(diǎn)，如可為乳腺癌藥物的研發(fā)和個(gè)體化治療提供理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，因此有必要提升其分離培養(yǎng)技術(shù)[5]。現(xiàn)就乳腺腫瘤細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的研究進(jìn)展予以綜述。

1 乳腺腫瘤細(xì)胞的常規(guī)分離方法

1.1酶消化分離法 酶消化分離法的原理是用特定的酶溶液將組織松散，從而溶解和破壞細(xì)胞間蛋白連接，獲得細(xì)胞懸液。目前應(yīng)用于酶消化分離法的酶主要包括膠原酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶以及中性蛋白酶等，通常是幾種酶按一定比例混合使用[6]。酶消化分離法的優(yōu)點(diǎn)在于可得到較多的細(xì)胞、維持細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞間不粘連，且可正常分裂并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，但所得的細(xì)胞懸液中混有雜細(xì)胞、易污染，且酶消化時(shí)間難以控制[7]。研究者可通過差速離心法、有限稀釋法以及單克隆挑選等純化細(xì)胞。

膠原酶對腫瘤細(xì)胞影響較小，適合消化纖維組織、上皮組織以及腫瘤組織。研究顯示，Ⅳ型膠原酶對乳腺癌的消化作用不強(qiáng)，不建議應(yīng)用；Ⅱ型膠原酶適用于消化乳腺癌中纖維成分較多的硬癌，且易得到乳腺癌單個(gè)細(xì)胞[8]。鈣離子、鎂離子以及血清蛋白的存在均會降低胰蛋白酶的活性，因此聯(lián)合應(yīng)用胰蛋白酶與乙二胺四乙酸消化分離組織時(shí)，在單用胰蛋白酶消化前應(yīng)避免血清的干擾[9]。胰蛋白酶不適合消化纖維組織成分較多的硬癌，適合消化細(xì)胞占比較大的髓樣癌[10]。此外，胰蛋白酶還可應(yīng)用于細(xì)胞傳代，以消除對腫瘤細(xì)胞干擾的成纖維細(xì)胞。王立斌等[11]用酶消化分離法分離乳腺癌細(xì)胞，在7～10 d時(shí)即出現(xiàn)懸浮生長的細(xì)胞克隆簇，且該細(xì)胞具有持續(xù)增殖的特性，最終成功分離出乳腺癌干細(xì)胞。史剛[12]用酶消化分離法成功獲得乳腺癌原代細(xì)胞，該原代細(xì)胞于第2天開始貼壁，第4天細(xì)胞完全貼壁，幾次傳代后細(xì)胞胞體較大，呈鋪路石樣外觀。

1.2機(jī)械分離法 機(jī)械分離法是指首先通過物理方法將乳腺腫瘤組織剪切成組織碎塊，再用腫瘤組織對應(yīng)的培養(yǎng)基輕輕沖洗組織碎塊，然后通過尼龍或鋼網(wǎng)(50～100 μm的開口)過濾、渦旋，并使用移液器(或順序較小的針)反復(fù)抽吸，快速生成單細(xì)胞懸浮液，其優(yōu)點(diǎn)在于可在短時(shí)間內(nèi)得到組織細(xì)胞[13]。但利用機(jī)械分離法分離腫瘤組織并不是獲得腫瘤細(xì)胞的合適技術(shù)，其物理剪切時(shí)間較長，可導(dǎo)致較多細(xì)胞死亡，而死亡的細(xì)胞又會分泌細(xì)胞降解酶，不利于細(xì)胞生長，影響細(xì)胞存活率[14]。Ljung等[15]利用機(jī)械分離法與酶消化分離法分別獲得乳腺癌原代細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與酶消化分離法相比，利用機(jī)械分離法分離會產(chǎn)生更多的死細(xì)胞和具有超二倍體的細(xì)胞。

1.3組織塊培養(yǎng)法 組織塊培養(yǎng)法是指將乳腺腫瘤組織碎片直接放入培養(yǎng)瓶中恒溫培養(yǎng)，其中部分細(xì)胞會慢慢從組織中游出并貼壁生長。組織塊培養(yǎng)法具有操作步驟簡單、培養(yǎng)成功率高、保留了細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與組織間的良好接觸等優(yōu)點(diǎn)，但細(xì)胞長出所需時(shí)間較長，且并不是每一個(gè)組織碎片均能長出細(xì)胞[16]。Hass和Bertram[17]利用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人乳腺癌活檢原代細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌原代細(xì)胞群持續(xù)生長，其完整的細(xì)胞外基質(zhì)和穩(wěn)定的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)可以為臨床制訂新的治療策略提供一個(gè)可重復(fù)的篩選平臺，以識別新的生物標(biāo)志物。王敏等[18]利用改良的組織塊培養(yǎng)法將裝有組織塊的培養(yǎng)瓶在孵箱中正置4～6 h，然后再滴入少量培養(yǎng)液，觀察組織塊的貼壁情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞爬出且鋪至瓶底約50%時(shí)，用胰蛋白酶消化法純化細(xì)胞獲得的細(xì)胞活性更好，最終成功在體外分離培養(yǎng)出人乳腺癌原代細(xì)胞。

2 乳腺腫瘤細(xì)胞的現(xiàn)代培養(yǎng)技術(shù)

在研究中使用原代細(xì)胞通常會遇到一個(gè)問題，即原代細(xì)胞只能培養(yǎng)很短的時(shí)間，隨著代次的增加細(xì)胞會停止增殖，且培養(yǎng)的細(xì)胞無法保證代次間的遺傳信息一致和正常的增殖。因此，在體外無限擴(kuò)增哺乳動物來源的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞對于個(gè)體化醫(yī)療和再生醫(yī)學(xué)均非常重要。目前常用的乳腺腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要包括3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和條件性重編程細(xì)胞(conditionally reprogrammed cells，CRCs)技術(shù)，兩者在實(shí)用性、功能性方面各具特色。

2.13D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是指將細(xì)胞放置于模仿體腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的3D培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)，細(xì)胞在3D系統(tǒng)的立體空間結(jié)構(gòu)中生長，構(gòu)成3D細(xì)胞-載體復(fù)合物[19]。3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)通過在體外構(gòu)建類似于體內(nèi)的細(xì)胞生長分化系統(tǒng)模擬腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，且其作為傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)天然環(huán)境的橋梁，具有2D細(xì)胞培養(yǎng)不可比擬的優(yōu)勢[20]。

成功建立一個(gè)3D模型最重要的是選擇合適的生物材料，生物材料包括天然聚合物和合成聚合物。天然聚合物主要包括膠原蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、海藻酸、瓊脂糖和殼聚糖等，常見的合成聚合物主要包括聚乙二醇、聚乳酸、聚己內(nèi)酯和聚氨酯等[21]。3D模型包括：①有支架的3D模型，細(xì)胞與基質(zhì)相互作用，可更好地模擬體內(nèi)腫瘤生長的微環(huán)境；②無支架的3D模型，細(xì)胞不能附著在培養(yǎng)皿表面，導(dǎo)致細(xì)胞聚集形成球狀體，其中，無支架的3D模型操作簡單、費(fèi)用低[22]。聚合物支架可以支持腫瘤細(xì)胞并允許細(xì)胞間營養(yǎng)物質(zhì)、氣體和信號交換，同時(shí)還可模擬細(xì)胞外基質(zhì)條件[23-24]。傳統(tǒng)基于支架的3D細(xì)胞培養(yǎng)只應(yīng)用單一的生物材料，而近年的研究多集中于支架材料的改造以及混合應(yīng)用多種材料進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)[25]。許保海等[26]利用膠原作為3D支架材料建立了一個(gè)3D乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)體系可有效維持乳腺腫瘤干細(xì)胞干性。還有研究表明，可將腫瘤細(xì)胞包裹于基質(zhì)支架形成的小囊中，從而形成大小均一的細(xì)胞球，這樣可顯著增加乳腺腫瘤細(xì)胞的活力[22]。彭雪梅等[27]利用人工基質(zhì)膠構(gòu)建體外3D細(xì)胞培養(yǎng)模型，首先將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231包裹于人工基質(zhì)膠中，然后再種于底部鋪有人工基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞形成了一種近似體內(nèi)的球形結(jié)構(gòu)，且呈現(xiàn)出乳腺癌的去極化特征，成功模擬了乳腺癌在體內(nèi)的真實(shí)形態(tài)。

3D生物打印是一項(xiàng)新興技術(shù)，在功能組織和器官的制造方面具有廣闊的應(yīng)用前景。3D生物打印技術(shù)是一種通過連續(xù)沉積細(xì)胞的生物墨水層創(chuàng)建3D結(jié)構(gòu)的生物制造方法[28]。生物打印已成為制造3D人類腫瘤模型的一種有前途的方法，這種模型可更好地再現(xiàn)體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵特征[29]。趙思雨等[30]通過3D生物打印技術(shù)構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞)3D水凝膠乳腺癌模型，結(jié)果顯示在水凝膠支架上培養(yǎng)的 MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞持續(xù)增殖并形成多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。生物打印技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可快速形成所需的腫瘤模型，其缺點(diǎn)在于成本較高和尺寸限制?，F(xiàn)有的3D生物打印機(jī)體積較大、成本較高，限制了其廣泛應(yīng)用[31]。

微流控技術(shù)的目的是通過在一個(gè)3D體外系統(tǒng)的芯片上復(fù)制血管網(wǎng)絡(luò)通道和實(shí)質(zhì)模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，重建傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)或動物研究中無法輕易建模的器官的功能單元[32]。微流體通道可定制流速灌注，且常充滿水凝膠前體細(xì)胞懸浮液，在光照下會凝膠化，可用于血管生成、機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、腫瘤細(xì)胞行為和藥物反應(yīng)研究等[33-34]。Truong等[35]設(shè)計(jì)了一個(gè)3D微流控共培養(yǎng)系統(tǒng)，在芯片上模擬腫瘤微環(huán)境的空間組織，對腫瘤-基質(zhì)相互作用進(jìn)行力學(xué)研究，并分別在3D腫瘤與間質(zhì)區(qū)域共培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞可通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中新型基因的表達(dá)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，從而提高遷移速度，可用于腫瘤分子機(jī)制研究。Nagaraju等[36]開發(fā)了一種新型3D微流控系統(tǒng)，該系統(tǒng)由同心三層細(xì)胞負(fù)載水凝膠組成，可同時(shí)研究腫瘤-血管串?dāng)_對乳腺癌細(xì)胞浸潤、內(nèi)滲以及血管成熟的影響。雖然目前微流體研究仍處于起步階段，但已成為研究乳腺癌的一個(gè)重要工具。

總之，腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境之間的相互作用可調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和基因表達(dá)等過程，體外3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可更好地了解腫瘤細(xì)胞及其分子機(jī)制，而3D模型是研究細(xì)胞遷移、存活和生長的理想模型[37]。

2.2CRCs技術(shù) CRCs技術(shù)是一種將銫源γ射線輻照過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Swiss -3T3-J2細(xì)胞)與人正常細(xì)胞或腫瘤上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，并添加Rho相關(guān)蛋白激酶抑制劑Y-27632使正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞獲得部分干細(xì)胞特性和在體外無限復(fù)制能力的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[38]。CRCs技術(shù)主要實(shí)驗(yàn)步驟包括：①J2細(xì)胞的輻照，當(dāng)J2細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，即可經(jīng)胰蛋白酶消化后制備細(xì)胞懸液，用銫源輻照器輻射J2細(xì)胞，劑量為3 000 rad，也可用絲裂霉素處理J2細(xì)胞，確保其不增殖，處理后的J2細(xì)胞應(yīng)立即與分離的原代細(xì)胞共培養(yǎng)或收集上清儲存；②乳腺腫瘤分離原代細(xì)胞，用酶消化分離法分離原代細(xì)胞；③共培養(yǎng)，將處理后的J2細(xì)胞立即與從組織中分離出的原代細(xì)胞在37 ℃、5%的二氧化碳條件下混合培養(yǎng)；④細(xì)胞分離，傳代過程中，胰蛋白酶消化腫瘤細(xì)胞與J2細(xì)胞的時(shí)間不同，J2細(xì)胞優(yōu)先脫落，從而將腫瘤細(xì)胞與J2細(xì)胞分離；⑤條件培養(yǎng)基培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，在3代共培養(yǎng)后，可采用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)法直接培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞[39]。CRCs技術(shù)無需基因修飾即可顯著提高細(xì)胞的體外增殖能力，并可在短時(shí)間內(nèi)獲取大量的原代細(xì)胞，且細(xì)胞可以無限傳代，繞過衰老信號，可廣泛應(yīng)用于新細(xì)胞系的建立[40]。但其具體機(jī)制目前尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)層細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子，而分泌的細(xì)胞因子與抑制劑混合可維持原代組織及相關(guān)細(xì)胞亞群生長[41]。

通過CRCs技術(shù)可成功培養(yǎng)乳腺癌[42]、膀胱癌[43]、前列腺癌[44]、胰腺癌[45]以及肝細(xì)胞癌[46]等惡性腫瘤細(xì)胞，且這些重編程的永生化細(xì)胞無基因操縱和染色體異常。周昕等[47]利用CRCs技術(shù)分離培養(yǎng)人原代乳腺癌干細(xì)胞，結(jié)果顯示原代乳腺癌干細(xì)胞可穩(wěn)定傳代擴(kuò)增至第9代，并保持乳腺癌細(xì)胞的特征。趙鴻雁等[48]利用CRCs技術(shù)成功培養(yǎng)出乳腺癌原代細(xì)胞和肺癌原代細(xì)胞，通過短串聯(lián)重復(fù)序列分析發(fā)現(xiàn)，利用CRCs技術(shù)擴(kuò)增的原代細(xì)胞保留了其來源組織的遺傳特性。Mahajan等[49]利用CRCs技術(shù)從6例乳腺癌患者腫瘤組織中分離培養(yǎng)出乳腺癌細(xì)胞，并在傳代培養(yǎng)后評估CRCs基因組的變化，結(jié)果顯示，乳腺癌CRCs保持了其來源的腫瘤組織的總拷貝數(shù)、基因突變和微RNA的表達(dá)模式。CRCs技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可快速、有效地在體外培養(yǎng)原代細(xì)胞，且只需微量細(xì)胞即可建系，同時(shí)還可保持腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，克服了傳統(tǒng)細(xì)胞系的缺點(diǎn)，經(jīng)CRCs培養(yǎng)體系建立的原代細(xì)胞可維持組織的染色體特征，并保持正常組織來源的生物學(xué)特性[50]。CRCs技術(shù)適用于新細(xì)胞系建立、腫瘤生物學(xué)評估以及抗腫瘤藥物的機(jī)制與療效研究、潛在腫瘤治療靶點(diǎn)的篩選等[51]。

3 乳腺腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的意義

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)可供體外藥敏研究。乳腺腫瘤原代細(xì)胞為個(gè)體化治療提供了理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，原發(fā)性腫瘤細(xì)胞可用于基因組測序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究，而研究數(shù)據(jù)可用于重新設(shè)計(jì)新的抗癌策略，對乳腺腫瘤的藥物研發(fā)具有重要意義?；熓侨橄侔┲委煹闹匾侄沃?，在化療前通過體外藥敏試驗(yàn)篩選出合適的藥物、避免藥物出現(xiàn)耐藥，可提高化療的療效[52]。

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)可通過建立動物移植模型將乳腺腫瘤細(xì)胞移植到同種動物體上，觀察腫瘤生長是否與該自發(fā)動物成瘤情況相同；也可將細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長情況，如腫瘤細(xì)胞成瘤時(shí)間和腫瘤大小等。乳腺癌動物模型的制作對乳腺癌的研究具有重要意義，而動物腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)也同樣重要[53-54]。腫瘤具有異質(zhì)性和復(fù)雜性，因此有必要建立更多的乳腺腫瘤細(xì)胞系，以代表原發(fā)腫瘤。細(xì)胞系是基礎(chǔ)研究和臨床研究的關(guān)鍵，也是基因和蛋白表達(dá)分析、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及藥理和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的決定性因素[55]。細(xì)胞系是實(shí)驗(yàn)室分析的金標(biāo)準(zhǔn)，具有操作簡單、自我復(fù)制、可用性和同質(zhì)性的優(yōu)點(diǎn)[56]。目前關(guān)于乳腺癌的研究大多是基于細(xì)胞系的研究。

4 小 結(jié)

原發(fā)性腫瘤細(xì)胞系已成為目前乳腺癌個(gè)性化治療不可或缺的工具。腫瘤細(xì)胞系的建立需要選擇合適的腫瘤細(xì)胞分離技術(shù)，其中酶消化分離法可得到較多的細(xì)胞，且可正常分裂并進(jìn)行傳代，但仍需優(yōu)化特定組織不同酶的濃度、比例以及消化時(shí)間等。CRCs 技術(shù)是一種新興技術(shù)，與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，其可更快速、有效地建立細(xì)胞系，且可保留來源腫瘤的遺傳特性，有助于從細(xì)胞分子角度了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制。而3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可提供腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用，更適用于評估藥物反應(yīng)?？傊脗鹘y(tǒng)分離培養(yǎng)方法分離乳腺腫瘤細(xì)胞并聯(lián)合目前新技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞傳代可以提高乳腺腫瘤細(xì)胞分離培養(yǎng)的成功率。