樊倩，張偉，李嚴(yán)為，歐陽(yáng)東，王虹霞

(1.天津市眼科醫(yī)院 天津市眼科學(xué)與視覺(jué)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市眼科研究所 南開(kāi)大學(xué)附屬眼科醫(yī)院眼科，天津 300020；2.上海市中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華醫(yī)院 上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院眼科，上海 200052)

細(xì)胞死亡是維持細(xì)胞周期及機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，主要分為程序性細(xì)胞死亡與調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死兩種類(lèi)型。依據(jù)細(xì)胞壞死發(fā)生過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化及具體分子機(jī)制，可以將調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死分為壞死性凋亡、焦亡、鐵死亡、自噬性死亡、多腺苷二磷酸核糖聚合酶1依賴性細(xì)胞死亡等[1-2]。不同調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死激活的下游分子途徑有所不同。鐵死亡作為調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死的一種重要類(lèi)型，主要通過(guò)長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶4(long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4)/溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3/花生四烯酸酯15-脂氧合酶通路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞死亡。目前認(rèn)為在諸多調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死的機(jī)制中，鐵死亡與心肌梗死、腦缺血再灌注損傷、實(shí)體器官移植等病理生理過(guò)程有關(guān)[3]。此外，鐵死亡還參與致盲性眼科疾病，如青光眼、老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)和視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)的發(fā)生發(fā)展。Sun等[4]通過(guò)體外培養(yǎng)的AMD標(biāo)準(zhǔn)模型證實(shí)，鐵死亡和自噬是谷胱甘肽減少誘發(fā)視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)死亡的兩種方式，鐵死亡抑制劑在抑制原代RPE細(xì)胞死亡方面優(yōu)于細(xì)胞凋亡或壞死性抑制劑。現(xiàn)就鐵死亡在致盲性眼病中的相關(guān)研究進(jìn)展予以綜述。

1 壞死性凋亡的作用機(jī)制

壞死性凋亡是由受體相互作用蛋白激酶1和受體相互作用蛋白激酶3調(diào)節(jié)的一種胱天蛋白酶(caspase)非依賴性細(xì)胞死亡途徑。壞死性凋亡途徑通過(guò)多種先天免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括死亡受體、干擾素、Toll樣受體或細(xì)胞內(nèi)RNA以及伴隨著受體相互作用蛋白激酶1/3和假激酶混合譜系激酶類(lèi)結(jié)構(gòu)域樣蛋白[5]。在細(xì)胞凋亡中，caspase家族的部分蛋白被炎癥小體激活，并被切割為成孔蛋白Gasdermin E，成孔蛋白激活后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，形成孔洞，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)溢出，細(xì)胞膜最終破裂崩解，其具體機(jī)制是通過(guò)炎癥小體感知刺激因素，進(jìn)而活化caspase-1，活化的caspase-1切割并激活白細(xì)胞介素-18、白細(xì)胞介素-1β等炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)一步切割Gasdermin D的N端序列，使其與膜結(jié)合并產(chǎn)生膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[6]。敲除Gasdermin E后，caspase-3的激活程度顯著降低，表明Gasdermin E可作為細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的另一個(gè)“開(kāi)啟”開(kāi)關(guān)。而鐵死亡作為調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死的一種重要類(lèi)型，主要通過(guò)ACSL4/溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3/花生四烯酸酯15-脂氧合酶通路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞死亡[3]。而多腺苷二磷酸核糖聚合酶1依賴性細(xì)胞死亡是一種與細(xì)胞凋亡或壞死性凋亡不同的程序性細(xì)胞死亡，該過(guò)程不需要caspase的參與，但是依賴于多聚二磷酸腺苷核糖信號(hào)和核凋亡誘導(dǎo)因子移位[7]。

2 鐵死亡的作用機(jī)制

2.1鐵死亡的特點(diǎn) 鐵死亡是較特殊的細(xì)胞死亡形式，2012年由Dixon等[8]首次報(bào)道，隨后引起廣大研究人員的重視。細(xì)胞死亡命名委員會(huì)更傾向于以細(xì)胞死亡的分子學(xué)進(jìn)行分類(lèi)，“鐵死亡”的名字由此而來(lái)。鐵死亡是一種細(xì)胞死亡過(guò)程，由鐵離子依賴的脂質(zhì)過(guò)氧化作用驅(qū)動(dòng)，以細(xì)胞膜完整性喪失和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物釋放為特征。鐵死亡具有以下特點(diǎn)：細(xì)胞死亡過(guò)程中伴隨著大量鐵離子的累積，同時(shí)出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化；在細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)中，線粒體變小、膜皺縮，同時(shí)線粒體嵴減少、消失，外膜破碎。這種死亡形式與鐵離子介導(dǎo)細(xì)胞的氧化還原失平衡相關(guān)，主要啟動(dòng)因素是細(xì)胞膜磷脂的過(guò)氧化，而鐵死亡中過(guò)氧化底物是多聚多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PL-PUFA)。細(xì)胞中影響PL-PUFA代謝的主要通路有鐵離子代謝通路、谷胱甘肽通路和泛醇/泛醌通路，其均可參與鐵死亡過(guò)程。亞鐵離子(Fe2+)是參與鐵死亡不可或缺的因素，在氧化應(yīng)激條件下，超氧化物可誘導(dǎo)細(xì)胞釋放Fe2+、血紅素、鐵硫簇和鐵蛋白。鐵蛋白的特異性自噬(又稱鐵蛋白吞噬)降解由核受體輔活化子4介導(dǎo)[9]，而核受體輔活化子4作為一種鐵蛋白受體，可識(shí)別和表達(dá)鐵蛋白，并將鐵蛋白招募至自噬體進(jìn)行溶酶體降解，繼而導(dǎo)致游離鐵離子釋放。敲減或過(guò)表達(dá)核受體輔活化子4基因可分別抑制或誘導(dǎo)鐵蛋白吞噬和鐵死亡。Olamine通過(guò)鐵離子螯合劑(去鐵胺或環(huán)磷酰胺)減少鐵離子過(guò)負(fù)荷，可阻斷erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，而提供外源性藥物鐵的來(lái)源(六水氯化鐵、檸檬酸鐵或檸檬酸鐵銨等)可促進(jìn)erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。

2.2鐵死亡的旁路調(diào)節(jié) 除鐵離子外，氨基酸代謝通路也參與鐵死亡的調(diào)節(jié)過(guò)程。谷氨酸和谷氨酰胺是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[10]。谷氨酸通過(guò)反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白胱氨酸，以1∶1的比例交換為胱氨酸。細(xì)胞外高濃度的谷氨酸通過(guò)阻斷半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致鐵死亡。當(dāng)谷氨酰胺缺乏或分解被抑制時(shí)，阻止胱氨酸輸入和胱氨酸缺乏不能引起脂質(zhì)過(guò)氧化、活性氧積累，最終導(dǎo)致鐵死亡。在谷氨酰胺分解過(guò)程中，谷氨酰胺酶2催化谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，是鐵死亡的必經(jīng)過(guò)程[11]，上調(diào)谷氨酰胺酶2可導(dǎo)致p53依賴性鐵死亡，p53在直接轉(zhuǎn)錄水平抑制溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)的表達(dá)，亦可通過(guò)轉(zhuǎn)錄上調(diào)下游的精脒/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶1通路，進(jìn)而參與鐵死亡過(guò)程。另外，p53可通過(guò)抑制二肽基肽酶-4的活性抑制鐵死亡[12]。

磷脂過(guò)氧化物酶——谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(phospholipid peroxidase glutathione peroxidase，GPX)4和ACSL4與脂質(zhì)過(guò)氧化密切相關(guān)，常作為鐵死亡過(guò)程的生物標(biāo)志物[13-14]。GPX4是一種抗氧化酶，可將潛在的毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物還原為無(wú)毒的脂質(zhì)醇，這是預(yù)防鐵死亡的重要過(guò)程，在此過(guò)程中，GPX4利用谷胱甘肽作為輔助因子，將還原型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽，隨后氧化型谷胱甘肽被谷胱甘肽還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/H+還原，使還原型谷胱甘肽再循環(huán)[14]。敲除GPX4可觸發(fā)依賴鐵離子和活性氧的鐵死亡，而GPX4過(guò)表達(dá)可抑制鐵死亡。小分子(如erastin)耗竭或GPX4抑制劑(1S，3R)-RSL3直接抑制GPX4的活性可導(dǎo)致GPX4失活，進(jìn)而導(dǎo)致PL-PUFA過(guò)氧化和脂肪酸自由基產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]，PL-PUFA過(guò)氧化是鐵死亡致細(xì)胞凋亡的主要環(huán)節(jié)。除直接抑制GPX4外，ACSL4還參與鐵死亡過(guò)程中氧化磷脂酰乙醇胺的產(chǎn)生，如花生四烯醇磷脂酰乙醇胺和腎上腺酰磷脂酰乙醇胺，它們是致死性脂質(zhì)種類(lèi)和鐵死亡的誘導(dǎo)劑。在敲除ACSL4基因時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡過(guò)程被阻斷[16]。

綜上所述，鐵死亡可能由鐵離子、谷氨酸及PL-PUFA的代謝累積或通過(guò)耗竭內(nèi)源性鐵死亡抑制劑GPX4與谷胱甘肽引起，并通過(guò)此通路參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)、RPE和視錐細(xì)胞的凋亡過(guò)程。既往研究顯示，激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-mehyl-D-aspartate，NMDA)/二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1通路可引起細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量增加，從而導(dǎo)致青光眼患者的RGC死亡，而鐵離子的積累或GPX4/谷胱甘肽水平的降低抑制了胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，可分別導(dǎo)致AMD、RP的RPE和視錐/視桿細(xì)胞凋亡。鐵離子螯合劑(去鐵胺)和鐵死亡抑制劑(鐵抑素-1)可阻斷RGC、RPE或視錐細(xì)胞的鐵死亡過(guò)程[17]。因此，鐵死亡機(jī)制在多種致盲性眼病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

3 鐵死亡與致盲性眼病

目前，鐵死亡的研究熱點(diǎn)和臨床應(yīng)用多集中于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、缺血再灌注損傷、腫瘤等，此外，眼科相關(guān)疾病(青光眼、AMD、RP、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)也涉及鐵死亡。

3.1鐵死亡與青光眼 RGC的退行性改變是青光眼的主要病理特征。由于鐵離子和谷氨酸的運(yùn)輸和代謝失調(diào)，多種通路通過(guò)激活鐵死亡參與RGC凋亡過(guò)程?，F(xiàn)已證實(shí)，NMDA受體通過(guò)激活鳥(niǎo)苷三磷酸結(jié)合蛋白Dexras1，進(jìn)而激活鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體(即二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1)，最終誘導(dǎo)鐵離子內(nèi)流。選擇性鐵離子螯合劑可顯著降低小鼠體內(nèi)NMDA的興奮性毒性，Dexras1的耗竭能夠減輕NMDA誘導(dǎo)的RGC死亡，提示Dexras1在介導(dǎo)鐵離子內(nèi)流和鐵死亡中起關(guān)鍵作用[18]。Sakamoto等[19]研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體腔注射N(xiāo)MDA第7天，視網(wǎng)膜RGC內(nèi)Fe2+積聚、細(xì)胞丟失，而鐵螯合劑治療可防止NMDA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷，同時(shí)減少Fe2+積聚和脂質(zhì)過(guò)氧化。NMDA受體在青光眼相關(guān)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，阻斷NMDA受體可能有預(yù)防鐵死亡的作用。此外，氧化應(yīng)激通路是導(dǎo)致青光眼RGC凋亡的另一個(gè)重要機(jī)制。一項(xiàng)臨床研究表明，原發(fā)性開(kāi)角型青光眼患者血漿維生素E和維生素C水平顯著低于健康人群，推測(cè)維生素E(SEC14L2)和維生素C(SLC23A2)相關(guān)基因的多態(tài)性分別與原發(fā)性開(kāi)角型青光眼的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[20]。然而，低水平血漿抗氧化劑以及原發(fā)性開(kāi)角型青光眼視網(wǎng)膜氧化損傷修復(fù)與鐵死亡的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

3.2鐵死亡與AMD 大量進(jìn)行性RPE凋亡是絕大多數(shù)AMD患者出現(xiàn)非新生血管性AMD的主要病變特征。目前認(rèn)為，鐵死亡參與調(diào)控AMD病程中的RPE凋亡。Hahn等[21]研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者視網(wǎng)膜中總鐵含量高于同齡健康人，鐵誘導(dǎo)生成的氧自由基參與AMD中RPE細(xì)胞的損傷過(guò)程。在采用叔丁基過(guò)氧化物處理的AMD體外細(xì)胞模型的RPE細(xì)胞中，鐵死亡抑制劑(鐵抑素-1)和鐵離子螯合劑(去鐵胺)可顯著逆轉(zhuǎn)Fe2+的累積、脂質(zhì)過(guò)氧化和谷胱甘肽耗竭等。外源性鐵的增加可促進(jìn)叔丁基過(guò)氧化物誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞死亡，該過(guò)程可被鐵抑素-1與去鐵胺抑制，表明部分叔丁基過(guò)氧化物誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞死亡由鐵死亡所致[22]。

目前AMD發(fā)生鐵死亡的直接證據(jù)尚未明確，但在AMD患者中可觀察到鐵離子運(yùn)輸和代謝失調(diào)的發(fā)生。干性AMD患者RPE中存在年齡依賴性的鐵含量增加[22-23]；AMD患者黃斑RPE和Bruch膜的總鐵水平高于同齡人群正常黃斑[24]；干性AMD患者房水鐵含量是正常人群的2倍以上[25]。由此可見(jiàn)，鐵代謝參與了AMD中RPE細(xì)胞的凋亡過(guò)程。

氧化應(yīng)激亦是導(dǎo)致RPE凋亡的重要機(jī)制之一，一些抗氧化酶功能失調(diào)被認(rèn)為是參與AMD中RPE細(xì)胞鐵死亡的原因。谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑，而GPX是谷胱甘肽生物合成至關(guān)重要的谷胱甘肽依賴酶。谷胱甘肽缺失導(dǎo)致GPX4失活，加速細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程，繼而引發(fā)鐵死亡[11]。谷胱甘肽對(duì)保護(hù)RPE免受活性氧損傷至關(guān)重要，谷胱甘肽的缺失可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞發(fā)生早衰，細(xì)胞活力降低，活性氧生成增加，GPX4表達(dá)降低，最終導(dǎo)致RPE凋亡[4]。谷胱甘肽缺乏引起的鐵死亡與ARPE-19細(xì)胞凋亡有關(guān)，鐵離子螯合劑(去鐵胺)和選擇性鐵死亡抑制劑(鐵抑素-1)可減輕細(xì)胞凋亡。由于ARPE-19細(xì)胞早衰可能與AMD的特征有關(guān)，谷胱甘肽功能異常引起的鐵死亡可能參與AMD的發(fā)病。

3.3鐵死亡與RP 目前人類(lèi)已知的感光細(xì)胞有視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞和RGC 3種。RP中視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞呈現(xiàn)累積性的退行性凋亡，鐵死亡可能參與光感受器細(xì)胞的死亡。在rd10小鼠RP模型中，鐵螯合劑(去鐵胺)可減弱鐵離子相關(guān)氧化應(yīng)激，光感受器退行性變與視網(wǎng)膜鐵蛋白減少以及脂質(zhì)過(guò)氧化水平的降低有關(guān)[26]。去鐵胺可減少暴露于強(qiáng)熒光燈下小鼠視網(wǎng)膜的光損傷，與未給予去鐵胺組小鼠相比，給予去鐵胺小鼠光感受器細(xì)胞的細(xì)胞核保存較好，存活的光感受器較多[27]。另有研究證實(shí)，VK28和VAR10303(鐵螯合藥物)可部分挽救rd10小鼠RP模型視錐細(xì)胞，顯著改善其視功能[28]。

多數(shù)對(duì)鐵死亡參與RP發(fā)病的研究顯示，上調(diào)某些抗氧化酶的活性可使光感受器免受氧化損傷。GPX4和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)是視網(wǎng)膜中重要的抗氧化酶。研究顯示，光感受器細(xì)胞中誘導(dǎo)過(guò)GPX4的轉(zhuǎn)基因小鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與功能更佳，而與SOD1水平正常轉(zhuǎn)基因小鼠相比，SOD1缺乏RP小鼠視網(wǎng)膜的損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)更輕[29]。SOD1缺乏rd10小鼠RP模型的視網(wǎng)膜氧化損傷加重，視錐細(xì)胞丟失加快，而SOD1和GPX4的共同表達(dá)可降低視網(wǎng)膜氧化損傷[29]。SOD1缺乏以及SOD1過(guò)度表達(dá)、GPX4表達(dá)水平降低的RP小鼠模型的視網(wǎng)膜氧化損傷增加，視錐細(xì)胞生理功能喪失加快[29]。以上研究提示，GPX4對(duì)保護(hù)光感受器免受氧化損傷至關(guān)重要，上調(diào)GPX4活性可能是治療RP的一種潛在途徑。

3.4鐵死亡與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是一種嬰幼兒多發(fā)的眼部惡性腫瘤，6%為常染色體顯性遺傳，94%為散發(fā)病例，其中25%為基因突變，余為體細(xì)胞突變。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可致盲甚至致死，確切病因目前尚未明確，且尚無(wú)有效的治療手段。目前認(rèn)為，p53基因突變、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1基因缺失是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)病的重要原因，而p53基因、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1基因均參與了鐵死亡。p53基因在細(xì)胞周期內(nèi)扮演重要角色，具有抑細(xì)胞凋亡、促細(xì)胞增生的作用，許多腫瘤中均有p53的表達(dá)，且通過(guò)普通化學(xué)性手段無(wú)法將p53檢出。p53的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中其表達(dá)水平明顯高于正常視網(wǎng)膜組織[30]。

4 小 結(jié)

近年來(lái)，鐵死亡相關(guān)的研究均取得了較大進(jìn)展，現(xiàn)已明確鐵死亡參與多種致盲性眼病的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程，包括青光眼、AMD和RP等。鐵死亡通路為退行性改變導(dǎo)致的致盲性眼病的研究提供了新的方向，針對(duì)致盲性眼病信號(hào)通路的研究可能有助于尋找新的治療方法，如明確特異性基因治療作用靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)有效的抑制性藥物，進(jìn)而干預(yù)或延緩疾病進(jìn)展。干預(yù)鐵死亡通路可能是一種潛在的眼病治療新策略，深入研究鐵死亡在眼科疾病中的作用及機(jī)制將為未來(lái)多種致盲性眼病的臨床治療帶來(lái)新的希望。