雷晶晶，高 可，康業(yè)斌，趙世民，苗 圃

(1.河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽 471023；2 河南省煙草公司洛陽市公司，河南 洛陽 471023)

【研究意義】在我國農(nóng)田土壤耕層中儲藏著大量的鉀、磷、氮等營養(yǎng)元素，其中鉀元素的平均含量為26 100 kg/hm2[1-2]。然而，這些鉀元素存在于各種固態(tài)的巖石中，不能以鉀離子的形態(tài)存在土壤中，從而不能被植物根系吸收利用，造成目前農(nóng)田管理中經(jīng)常遇到的土壤富鉀而植物生長缺鉀的情況。因此，為了提升植物的質(zhì)量需要提高土壤中的可溶性鉀含量，需要多途徑多方面解決植物缺鉀問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在煙株生長過程中普遍出現(xiàn)缺鉀現(xiàn)象，缺少鉀元素會導(dǎo)致煙葉邊緣和煙葉前端下卷，葉片軟塌，不平整，出現(xiàn)黃綠色或紅銅色暈斑、棕褐色壞點(diǎn)。嚴(yán)重缺鉀時煙葉葉肉退綠，葉片邊緣枯黃破損，導(dǎo)致煙草大量減產(chǎn)，給煙農(nóng)帶來經(jīng)濟(jì)損失[3]。研究表明，鉀、氮、磷元素已成為了影響農(nóng)作產(chǎn)量與質(zhì)量的三個重要元素[4]。提高土壤耕層中植物可直接吸收利用的鉀含量，促進(jìn)植物生長發(fā)育已經(jīng)成為目前高效利用土壤營養(yǎng)元素的研究熱點(diǎn)之一。目前，當(dāng)煙草生產(chǎn)過程中大面積出現(xiàn)缺鉀現(xiàn)象時，煙農(nóng)經(jīng)常采用直接在土壤中拌入鉀肥或者將含有鉀的化學(xué)品制成溶液噴施在葉片，達(dá)到預(yù)防煙株缺鉀或快速補(bǔ)鉀的目的[5-6]。然而，這種直接在土壤中追肥和葉面噴施鉀溶液的方式會使土壤板結(jié)、土質(zhì)酸化、微生物類群失衡，這些不良情況的發(fā)生會導(dǎo)致煙株感染土傳病害的情況加重，影響煙草的品質(zhì)，增加煙草的生產(chǎn)成本。其中亞歷山大羅夫[7]將能夠分解硅酸鹽礦物中鉀元素的細(xì)菌命名為膠質(zhì)芽孢桿菌或膠凍樣芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)，在國內(nèi)研究中經(jīng)常稱其為鉀細(xì)菌[8-9]。郭玲玲等[10]通過在相同土壤中加入不同質(zhì)量的鉀長石粉并接入相同數(shù)量的解鉀菌，檢測解鉀菌的數(shù)量變化來初步分離篩選獲得具有較高解鉀活性的解鉀細(xì)菌，分離出的菌株比實(shí)驗(yàn)室保存菌種K02的解鉀效率高3.6倍，比菌種K01高13倍。韓曉陽等[11]將山東茶園土壤中得到的最強(qiáng)解鉀效率的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K2制成微生物菌劑。地施該微生物菌劑后土壤中有效鉀和有效磷含量顯著提高，比對照分別提高28.40%和28.49%，茶葉產(chǎn)量提高36.30%，為開發(fā)適合山東茶園土壤環(huán)境的專用微生物菌劑提供相關(guān)參考。李華等[12]通過紫外線誘導(dǎo)膠凍樣芽孢桿菌基因突變得到2株誘導(dǎo)菌株，使其比原始菌株的解鉀能力分別提高1282.35%，1909.80%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于我國煙田尤其是洛陽煙田煙株根圍土壤中解鉀菌的報(bào)道很少，因此需要針對洛陽煙田土壤環(huán)境研發(fā)專用的微生物菌劑解離土壤中的固態(tài)鉀。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究開展洛陽煙田煙株根圍土壤中解鉀菌的相關(guān)分析，為解決洛陽煙田鉀肥供需矛盾，增加洛陽煙葉的產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品：2017年7—9月，在河南省洛陽市小界鄉(xiāng)徐村、大坪鄉(xiāng)宋嶺、楊莊村三地植煙區(qū)，根據(jù)煙田實(shí)際面積，隨機(jī)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)選擇5株健康煙株，在煙株莖稈基部一側(cè)去除表層0～5 cm的土壤，用鐵鏟挖出15～20 cm帶根土壤。用小刀將距根系2 mm以上的土壤輕輕剝離，抖落剩余土壤作為根圍土壤樣品進(jìn)行收集。將采回的根圍土壤樣品在通風(fēng)處進(jìn)行自然晾干，去除小石塊等雜質(zhì)。剩余土樣經(jīng)研缽研磨后過2 mm孔徑的篩子(10目)，用四分法留樣并編號(表 1)。

表1 煙株根圍土壤樣品基本信息

培養(yǎng)基：硅酸鹽細(xì)菌分離培養(yǎng)基[13]，NA培養(yǎng)基，淀粉水解培養(yǎng)基，明膠液化培養(yǎng)基，M.R試驗(yàn)培養(yǎng)基，V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基，鹽培養(yǎng)基，石蕊牛乳培養(yǎng)基，糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基，酸鹽還原培養(yǎng)基，休和賴夫森二氏培養(yǎng)基用于細(xì)菌的生理生化鑒定[14-15]。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號23575。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化 土壤解鉀細(xì)菌的分離采用稀釋涂布平板法。將處理好的土樣加入無菌水制成系列濃度梯度的懸浮液，均勻涂布到硅酸鹽細(xì)菌篩選培養(yǎng)基平板上，將其放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。每個處理重復(fù)5次。待菌落長出，選擇無污染，細(xì)菌菌落分散相對均勻的3個平板，從中挑出與標(biāo)準(zhǔn)菌株23575菌落形態(tài)特征相似，即無色透明、半玻璃狀并富有彈性的菌落進(jìn)行下一步純化試驗(yàn)，將菌株接種到液體NA培養(yǎng)基中在28 ℃、170 r/min條件下持續(xù)震蕩過夜培養(yǎng)，將所得菌液稀釋適當(dāng)濃度后涂布于固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，重復(fù)上訴步驟至平板上菌落一致后，轉(zhuǎn)接至NA平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h后，4 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.2.2 細(xì)菌鑒定 (1)形態(tài)學(xué)鑒定。待測菌株純化后接種在NA平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h，待長出單一菌落后，平板觀察待測菌落的大小、凸起形狀、菌落邊緣、透明程度、顏色、粘稠度等形態(tài)特征。革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體及芽孢的形態(tài)[17-18]，記錄所有菌株的相關(guān)數(shù)據(jù)。

(2)生理生化鑒定。按照常規(guī)的細(xì)菌生理生化鑒定方法對初步篩選出的菌株進(jìn)行厭氧性、耐鹽性、對不同碳源的利用等一系列生理生化試驗(yàn)，以膠凍樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對照，觀測其生理生化特性。

(3)16S rDNA序列分析。選擇菌株形態(tài)特征，生理生化反應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)菌株完全一致的待測菌株在NA平板上活化培養(yǎng)48 h后，通過細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA，送往上海生物工程(上海)有限公司測序。將待測菌株序列與已登記的解鉀菌基因序列進(jìn)行同源性比較，使用MEGA 6軟件將目標(biāo)序列及其同源性高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.2.3 細(xì)菌解鉀能力測定 依據(jù)GBT 8574—2010 復(fù)混肥料中鉀含量測定(四苯硼酸鉀重量法)[20]進(jìn)行解鉀能力的測定。本試驗(yàn)解鉀能力測定原理為：在以鉀長石為唯一鉀源的待測發(fā)酵菌液中加入四苯硼酸鈉溶液，使其與鉀離子充分結(jié)合形成四苯硼酸鉀沉淀，所得沉淀恒溫干燥冷卻后稱重。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果，分析供試菌株的解鉀能力。

(1)種子液的制備。將發(fā)育良好的解鉀菌菌落接種到種子液中搖培，使每瓶菌體含量大概2.0×108CFU/mL。

(2)發(fā)酵液的制備。每瓶加入液體培養(yǎng)基95 mL，鉀長石粉使用前，用20%的鹽酸溶液消耗表面的游離鉀和交換性鉀。

(3)分別吸取菌體含量2.0×108CFU/mL左右的種子液5 mL加入對應(yīng)編號的發(fā)酵液中。以未接待測菌的種子液作為空白對照，在搖床中培養(yǎng)7 d。

(4)用過氧化氫試劑對發(fā)酵液進(jìn)行灰化處理，使待測液不再粘稠。3500 r/min，離心10 min后收集上清液，用蒸餾水定容至50 mL。

(5)在潔凈的培養(yǎng)皿的底部寫下編號，在培養(yǎng)皿中各放一張孔徑0.45 μm的混和濾膜，用天平各稱量3次，記錄數(shù)據(jù)，備用。

(6)在處理后的試液中逐滴加入四苯硼酸鈉溶液，不停地?cái)嚢?，直至不再產(chǎn)生沉淀，再過量加入7 mL四苯硼酸鈉溶液，持續(xù)攪拌，使四苯硼酸鈉與試液中的鉀離子充分結(jié)合，靜置15 min，濾膜過濾。

(7)計(jì)算數(shù)據(jù)，將步驟(6)得出的數(shù)據(jù)減去步驟(5)得出的數(shù)據(jù)，得出沉淀的質(zhì)量。

(8)數(shù)據(jù)分析。鉀離子含量越多沉淀質(zhì)量越大，即該菌株的解鉀能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及革蘭氏染色反應(yīng)

從河南省洛陽市嵩縣、汝陽、洛寧3個縣煙草不同生育期的煙田根圍土壤樣品分離獲得14個純菌株，其中菌株001、003、005、006、007、008、011、012、013的菌落呈圓形、白色或乳白色、透明、邊緣整齊、表面光滑凸起、呈粘稠狀，革蘭氏染色反應(yīng)呈陽性，菌體為桿狀，表觀特征與標(biāo)準(zhǔn)菌株23575相似；菌株002、004、009、010、014在菌落粘稠性等方面與標(biāo)準(zhǔn)菌株不一致(表2)。

表2 菌株形態(tài)學(xué)與革蘭氏染色觀察

2.2 生理生化特性檢測

選取待測菌株中表觀特征與標(biāo)準(zhǔn)菌株23575相似的9個菌株進(jìn)行生理生化檢驗(yàn)，菌株001、005、006、007、008、011、012為兼性厭氧性細(xì)菌，與過氧化氫酶反應(yīng)陽性，可使水解淀粉、糖醇發(fā)酵、硝酸鹽還原，V-P測定與M.R測定均顯示陽性，在石蕊牛乳試驗(yàn)反應(yīng)中均可以產(chǎn)酸，不能使明膠液化，且能利用檸檬酸鹽，生理生化反應(yīng)特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株完全一致；菌株003、013在糖醇發(fā)酵與牛奶固化方面與標(biāo)準(zhǔn)菌株不同(表3)。

表3 菌株生理生化反應(yīng)

2.3 16S rDNA序列分析

將菌株001、003、005、006、007、008、011、012、013的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，所得基因登錄號分別為MN227330、MN227332、MN227334、MN227335、MN227336、MN227337、MN227340、MN227341、MN227342。將待測菌株的序列在NCBI上比對后，結(jié)果(圖1)表明，菌株005、008的16S rDNA 序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄號為EU048557、HM579819、DQ898309的膠凍樣芽孢桿菌的同源性高于99%。根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化特性并結(jié)合16S rDNA序列分析結(jié)果，將菌株005與008鑒定為膠凍樣芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)。

圖1 菌株16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed by strains 16S rDNA gene sequence

2.4 菌株005和008的解鉀能力

菌株005、008與標(biāo)準(zhǔn)菌株23575的平均沉淀質(zhì)量分別為0.140、0.136、0.166 g，均大于對照組(0.046 g)，說明標(biāo)準(zhǔn)菌株23575與待測菌株005和008都具有解鉀能力；采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果(表4)表明，菌株005、008與標(biāo)準(zhǔn)菌株23575的平均沉淀質(zhì)量差異顯著(P<0.05)。

表4 菌株005、008和23575的解鉀能力方差分析

3 討 論

本研究分離獲得2株具有較強(qiáng)解鉀能力的細(xì)菌，初步檢測其解鉀能力，為研發(fā)具有解鉀功效的微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)利用硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基，從河南省洛陽市嵩縣、汝陽、洛寧3個縣煙草不同生育期的煙田根圍土壤樣品分離獲得純菌株14個，通過復(fù)篩和16S rDNA序列分析鑒定出菌株005、008為解鉀菌中的膠凍樣芽孢桿菌，均為兼性厭氧性細(xì)菌，與過氧化氫酶反應(yīng)為陽性，可使淀粉水解、糖醇發(fā)酵、硝酸鹽還原，在石蕊牛乳試驗(yàn)反應(yīng)中均可以產(chǎn)酸，不能使明膠液化，且能利用檸檬酸鹽。這與石禹等[21]進(jìn)行幾株硅酸鹽細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析的方法基本一致。試驗(yàn)中菌株005、008在對鉀長石為原料的解鉀能力測定結(jié)果中不如標(biāo)準(zhǔn)菌株解鉀效果顯著，關(guān)于待測菌株的解鉀測定，本試驗(yàn)采用四苯硼酸鈉測定法，該方法的試驗(yàn)原理是首先依據(jù)控制變量原則將所有待測菌株在種子液中培養(yǎng)到對數(shù)期(菌體含量大概2.0×106CFU/mL)，在同等菌量、同等礦石量的條件下比較菌株的解鉀能力。吳凡等[22]從桑樹根際土樣中分離獲得29株解鉀細(xì)菌，解鉀能力測定顯示，解鉀菌效率最高達(dá)到41.79%。趙飛等[23]從山東地區(qū)不同植物根際土壤中初篩到 23 株生長勢良好的解鉀菌，利用火焰分光光度計(jì)計(jì)算鉀含量，發(fā)酵液中鉀含量增加25.4%和29.8%。因此，由于環(huán)境和生態(tài)演化機(jī)制的不同，處于不同生境中的分離菌，其釋鉀能力也存在著明顯差異。解鉀菌的解鉀能力也受解鉀菌的種類、礦物類型和礦物含量等方面的影響[24-25]?？梢酝ㄟ^優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件來提高鉀菌的解鉀能力，也可通過改變含鉀礦物的硬度或粒度、解鉀過程中的pH、解鉀菌的基因量的表達(dá)等方面探究提高解鉀菌的解鉀能力，為植物利用有效鉀提供更多的研究方向，解鉀菌生物肥可耐受各種不良的環(huán)境條件，容易儲存、便于運(yùn)輸、大規(guī)模生產(chǎn)、工藝簡單、成本較低，在微生物肥料工業(yè)生產(chǎn)中越來越受到人們的重視和歡迎。但從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際情況和功能菌株在國內(nèi)外農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用現(xiàn)狀來看，雖然解鉀菌的解鉀功能對植物的生長有利無害，但解鉀菌在農(nóng)田產(chǎn)生解鉀效果的作用周期長、解鉀效能容易受土壤環(huán)境的影響，無法提高煙農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益。因此篩選出具有高效穩(wěn)定解鉀活性的解鉀菌株，是目前解鉀菌研究的主要方向。

研究表明，有的解鉀菌雖破壞鉀長石釋放可溶性鉀的能力顯著，但其在農(nóng)田土壤中的解鉀絕對量卻十分有限[26]。許成悅等[27]利用芝麻餅及牛糞作為基質(zhì)，將解鉀菌接種在2種基質(zhì)上發(fā)酵，干燥制成菌肥，結(jié)果表明加入解鉀菌的芝麻餅及牛糞基質(zhì)能夠促進(jìn)河南省駐馬店泌陽縣地區(qū)煙草下層側(cè)根的生長，可能增加煙株的根系體積、株高和煙葉的數(shù)量。因此，本試驗(yàn)所分離鑒定得到的膠凍樣芽孢桿菌通過試驗(yàn)證明是生產(chǎn)生物鉀肥的理想菌株，可為進(jìn)一步通過基因工程技術(shù)和改良鉀肥基質(zhì)等方法來提高菌種在實(shí)際生產(chǎn)中的解鉀活力和解鉀穩(wěn)定性提供相關(guān)試驗(yàn)基礎(chǔ)，為微生物肥料的開發(fā)應(yīng)用提供相關(guān)的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)從河南省洛陽市嵩縣、汝陽、洛寧3個縣不同生育期的煙株根圍土壤樣品中分離獲得14株硅酸鹽細(xì)菌，均為陽性、桿狀細(xì)菌。依據(jù)14個菌株的厭氧性以及對不同碳源、檸檬酸鹽的利用等生理生化反應(yīng)特征，結(jié)合16S rDRNA序列比對分析結(jié)果，將菌株005、008鑒定為膠凍樣芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)，隸屬于細(xì)菌域，厚壁菌門，芽孢桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬。解鉀能力測定表明，菌株005、008均具有較強(qiáng)的解鉀能力，可為進(jìn)一步開發(fā)具有解鉀功能的生物有機(jī)肥提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)和菌種資源。