王麗娟，趙佳利，楊 姣，黃 娟，陳慶富，鄧 嬌

(貴州師范大學蕎麥產(chǎn)業(yè)技術研究中心，貴陽 550001)

【研究意義】苦蕎 (FagopyrumtartaricumGaertn) 是蕎麥廣泛栽培的品種之一[1-2]，被作為藥食同源的典型代表。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，苦蕎是一種天然功能食品，有食用、保健、藥用等功效，并有“五谷之王”的美譽[3-5]。以苦蕎種子加工而成的食品以及芽菜受到廣大消費者的喜愛[6-7]。蕎麥芽菜是由蕎麥種子萌發(fā)而成的幼苗。有研究報道，與未發(fā)芽的種子相比，蕎麥芽菜營養(yǎng)更合理豐富，降解了未發(fā)芽籽粒中抗營養(yǎng)因子如蛋白酶抑制劑，消除了過敏蛋白源等。此外，苦蕎芽菜因富含花色苷廣受全世界消費者的青睞[8-9]?；ㄉ諏儆陬慄S酮化合物，是主要存在于植物液泡中的水溶性天然色素，能使花、果等呈現(xiàn)多彩的顏色，利于植物的生長繁衍且有益于人體健康，具有美容養(yǎng)顏、抗炎抑癌等功效，被認為是具有生理功能的食物營養(yǎng)素[10-11]。目前國內(nèi)外對蕎麥類黃酮化合物的研究主要在黃酮、蘆丁等代謝物上，而鮮有關于花色苷的研究[12-14]。植物花色苷生物合成途徑的研究已較深入，該通路上的結(jié)構(gòu)基因包括查爾酮合成酶基因 (Chalconesynthase,CHS)、查爾酮異構(gòu)酶基因 (Chalconeisomerase,CHI)、黃烷酮3-羥化酶基因 (Flavanone3-hydroxylase,F3H)、二氫黃酮醇-4-還原酶基因 (Dihydroflavonol-4-reductase,DFR)、花色苷合成酶基因 (Anthocyanidinsynthase,ANS)、花色苷3-O-糖苷轉(zhuǎn)移酶基因 (Anthocyanin3-O-glucosyltransferase,UFGT) 等[15-17]。花色苷的生物合成主要受3種轉(zhuǎn)錄因子家族 MYB、bHLH、WD40 的調(diào)控[17]。光作為影響花色苷合成的重要環(huán)境因子之一，可通過直接或間接調(diào)控花色苷的積累，從而影響植物的品質(zhì)[18-19]。因此，探究光對苦蕎花色苷合成的影響具有重要意義。【前人研究進展】已有研究證明光因子 COP1 (Constitutive Photomorphogenic 1) 是參與光調(diào)控植物生命過程的負調(diào)控因子，其位于光信號轉(zhuǎn)導中心，通過26 S 蛋白酶體系統(tǒng)泛素化降解多種光正調(diào)控因子如 ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5)、LONG HYPOCOT-YL IN FAR RED (HFR1)、LONGAFTER FAR-RED LIGHT 1 (LAF1) 等，從而影響植物花色苷合成、光形態(tài)建成、生物節(jié)律等過程[19-20]。COP1 是一種保守的 RING 型 E3 泛素連接酶[21]，在植物中的定位是光依賴型。在黑暗環(huán)境下被運輸?shù)郊毎酥?，以光激活因?HY5、HFR1、LAF1 等為靶點，使其泛素化，通過26 S 蛋白酶體途徑被降解，從而促進暗形態(tài)建成；在光照條件下，COP1 從細胞核轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中，光感受器會抑制 COP1，進而削弱其對植物光形態(tài)建成的抑制作用，促進了 HY5 等激活因子對下游靶基因的正調(diào)控作用，如與花色苷生物合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因CHS、DFR等啟動子結(jié)合，促進花色苷積累[19-22]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，COP1基因已經(jīng)在蘋果 (Malusdomestica)、擬南芥 (Arabidopsisthaliana)、甜櫻桃 (PrunusaviumL.)、茄子 (SolanummelongenaL.) 等物種中完成了分離和鑒定[20-25]，具有調(diào)控花色苷的生物合成的功能。但在苦蕎中關于COP1基因調(diào)控花色苷的合成相關研究報道較少，F(xiàn)tCOP1基因仍有待鑒定。【擬解決的關鍵問題】通過克隆苦蕎COP1基因，利用生物信息學方法解析該基因序列和編碼蛋白，并對光照和黑暗條件下苦蕎芽菜中COP1基因與花色苷結(jié)構(gòu)基因的表達水平、花色苷含量的相關性進行分析，為揭示苦蕎中光調(diào)控花色苷合成的分子機制和后續(xù)利用COP1基因改良苦蕎品質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以貴州師范大學蕎麥產(chǎn)業(yè)技術研究中心保存的苦蕎品種晉蕎2號為研究材料，借鑒朱麗偉等[26]種子萌發(fā)的方法，對種子進行萌發(fā)前處理后分別置于溫度為25 ℃、濕度為70% 的光周期不同的培養(yǎng)箱(光照培養(yǎng)箱16 h 光照/8 h 黑暗和黑暗培養(yǎng)箱24 h 黑暗)中培養(yǎng)，7 d后取發(fā)芽的苦蕎芽菜先在液氮中速凍，存于-80 ℃ 冰箱備用。

1.2 苦蕎芽菜 RNA 的提取和 cDNA 合成

將光照和黑暗處理的苦蕎芽菜用液氮速磨成粉末，利用多酚多糖植物總 RNA 提取試劑盒(北京莊盟)提取 RNA，利用 ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix (TOYOBO) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到 cDNA，存于-20 ℃ 備用。

1.3 基因克隆

將來源于 NCBI 網(wǎng)站的擬南芥 COP1 蛋白序列與苦蕎基因組數(shù)據(jù)庫 (http://mbkbase.org/Pinku1/) 比對，獲取苦蕎COP1同源基因 (FtPinG0004028300.01.T01) 的 CDS 序列，命名為FtCOP1。利用Primer 5軟件設計FtCOP1基因特異性引物(正向引物序列：5′-ATGGATGAGAGTTCAACAGGAG-3′；反向引物序列：5′-AAGTGGGAATTTTGATGTTT-3′)進行 PCR 擴增，將 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1% 瓊脂糖凝膠電泳，切下目標條帶，回收，并連接到 T 載體，轉(zhuǎn)化到 DH5α大腸桿菌，將菌落 PCR 鑒定為陽性的單克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序獲得目標基因序列。

1.4 生物信息學分析

FtCOP1基因的 CDS 序列利用在線軟件 ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 進行確認，并采用 DNAMAN 8軟件對克隆的測序結(jié)果進行驗證分析，利用 Gene Structure Display Server (GSDS) 分析基因結(jié)構(gòu)。該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、保守結(jié)構(gòu)域分別使用在線軟件 ExPaSy (http://expasy.org/tools/protparam.html)、ProtScale (https://web.expasy.org/protscale)和(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/domains-structures/) 進行預測；跨膜區(qū)和亞細胞定位分別使用 TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html) 和 PSORT (https://www.genscript.com/psort.html#__NO_LINK_PROXY__) 進行預測；同時利用 SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 和 SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org) 在線軟件分析其蛋白結(jié)構(gòu)；利用 NCBI Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 和 MEGA 7.0(1000次 bootstrap)進行多序列比對與進化樹的構(gòu)建，通過 MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme) 預測 motif，并通過 TBtools 軟件進行修飾[27]。

1.5 花色苷含量分析

參考 Ronchi 等[28-29]花色苷的提取與測定方法。將存于-80 ℃ 中的苦蕎芽菜取出，用液氮速磨至細粉狀，取1 g 置于4 mL 含有1% HCl 甲醇溶液提取液中，混勻后在4 ℃ 環(huán)境中靜置12 h，12 000 r/min 離心10 min，吸取上清并用含1% HCl 甲醇溶液的提取液定容到4 mL?；靹蚝鬁y其在657 nm和530 nm處的吸光度，根據(jù)花色苷含量公式Q=(A530-0.25×A657)/M(M為樣品重量，Q為花色苷含量)，計算在暗處理和光處理下的苦蕎芽菜花色苷的含量，每個樣品做3次生物學重復[30]。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

利用Primer 5軟件設計FtCOP1基因與花色苷合成結(jié)構(gòu)基因CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT的實時熒光定量PCR(RT-qPCR)的引物(表1)，以苦蕎Actin(FtPinG0002124000.01.T05)為內(nèi)參基因[31]。使用iTaq Universal SYBR?Green Supermix (Bio-Rad) 儀器，反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，55℃ 30 s，40次循環(huán)；95 ℃ 10 s，65～95 ℃ 繪制溶解曲線?；虻南鄬Ρ磉_量用2-ΔΔCt方法。每個樣品做3次重復。

表1 熒光定量 PCR 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 FtCOP1 基因全長 cDNA 的克隆

從苦蕎芽菜提取總 RNA，電泳圖如圖1所示，以逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 為模板，通過 PCR 克隆得到一條略大于2000 bp 的目標片段(圖2)，經(jīng)測序分析，目標片段全長2082 bp，與FtCOP1基因完整的 CDS 序列完全一致(圖3)，該基因包含12個內(nèi)含子和13個外顯子，編碼681個氨基酸(圖4)。

M1：DL2000 DNA Marker；CK：光照處理；D：黑暗處理M1:DL2000 DNA Marker; CK: Light treatment; D: Dark treatment圖1 苦蕎芽菜的總 RNA 電泳圖Fig.1 Total RNA electrophoretogram of tartary buckwheat

M2：DL4500 DNA Marker；1：FtCOP1基因M1:DL4500 DNA Marker; 1: FtCOP1 gene圖2 PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electropherogram of PCR product

圖3 FtCOP1 的基因序列及推測的氨基酸序列Fig.3 FtCOP1 gene sequence and predicted amino acid sequence

圖4 FtCOP1 基因結(jié)構(gòu)Fig.4 Genetic structure of FtCOP1

2.2 FtCOP1 蛋白的基本特征

FtCOP1 蛋白分子式為 C3300H5217N937O1044S36，分子量為75.875 kD，等電點為6.23，該蛋白帶正電荷和負電荷氨基酸殘基數(shù)目分別為80和88，脂肪系數(shù)為76.02，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為53.37，由此推斷其為不穩(wěn)定蛋白。亞細胞定位預測結(jié)果顯示該蛋白定位在細胞核的可信度最高 (69.6%)，其次是細胞質(zhì) (17.4%)。

親疏水性預測結(jié)果(圖5)表明，大部分為負值，其中疏水性最大正值為2.2，親水性最小負值為-3.2，總平均親水性為 -0.415，表明 FtCOP1 蛋白屬于親水性蛋白。通過 Phobius 分析結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn)1個可能的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，內(nèi)外螺旋跨膜結(jié)構(gòu)在66～84的氨基酸區(qū)域，無信號肽存在。采用 SOPMA 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)(圖7)，預測 FtCOP1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)元件有無規(guī)則卷曲 (41.26%)、α螺旋 (33.48%)、延伸鏈 (20.12%) 和β轉(zhuǎn)角 (5.14%)與預測的三級結(jié)構(gòu)一致(圖8)。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示(圖9)，該蛋白屬于 WD40 超家族，C 末端含有高度保守的 RING 指區(qū)，N 末端含有7個色氨酸—天冬氨酸重復序列 (WD40) 蛋白互作結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)合位點 RING-HC_COP1、zf-C3HC4_2 和 RING，這些結(jié)構(gòu)域在維持生物學過程中發(fā)揮著重要作用[23-24,32]。

圖5 FtCOP1 蛋白的親/疏水性Fig.5 Hydrophilic/hydrophobic of FtCOP1 protein

圖6 FtCOP1 蛋白跨膜與信號肽Fig.6 Transmembrane and signal peptide of FtCOP1 protein

Hh： α螺旋；Ee：延伸鏈；Tt：β轉(zhuǎn)角；Cc：無規(guī)卷曲Hh: α helix; Ee: Extended strand; Tt:β turn; Cc: Random coil圖7 FtCOP1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測Fig.7 Prediction of secondary structure of FtCOP1 protein

圖8 FtCOP1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測Fig.8 Prediction of tertiary structure of FtCOP1 protein

2.3 苦蕎與其它物種 COP1 蛋白的系統(tǒng)進化關系及保守性

將 FtCOP1 蛋白與藜麥 (Chenopodiumquinoa)、甜櫻桃 (Prunusavium)、蓮 (Nelumbonucifera)、金錢橘 (Citrusclementina)、葡萄 (Vitisvinifera)、茄子 (Solanummelongena)、擬南芥 (Arabidopsisthaliana)、杜鵑 (Rhododendronsimsii)、藍果樹(Nyssasinensis)、水稻 (Oryzasativa)、蘋果 (Malusdomestica)的 COP1 蛋白序列進行多重比對結(jié)果(圖10)發(fā)現(xiàn)，在不同種植物中 COP1 蛋白序列相對保守，含有高度同源的 RING 和 WD40 重復結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白在植物進化上保守性較高。

圖9 FtCOP1 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測Fig.9 Prediction of conserved domain of FtCOP1 protein

Ft：苦蕎(用黑三角標記)；Cq：藜麥；Nn：蓮；Cc：金錢橘；Ns：藍果樹；Os：水稻；At：擬南芥；Md：蘋果；Pac：甜櫻桃；Vv：葡萄；Sm：茄子；Rs：杜鵑；下同F(xiàn)t: Fagopyrum tartaricum (marked with a back triangle); Cq: Chenopodium quinoa; Nn: Nelumbo nucifera; Cc: Citrus clementina; Ns: Nyssa sinensis; Os: Oryza sativa; At: Arabidopsis thaliana; Md: Malus domestica; Pac: Prunus avium; Vr: Vitis riparia; Sm: Solanum melongena; Rs: Rhododendron simsii; The same as below圖10 FtCOP1 與其他物種 COP1 蛋白序列的多重比對Fig.10 Multiple comparison of the FtCOP1 protein sequence with COP1 proteins from other species

對苦蕎與上述提及的11種植物COP1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明藜麥 COP1 蛋白與 FtCOP1 蛋白的親緣關系最近(圖11)。這些 COP1 蛋白含有的 motif 種類、位置及數(shù)目相似，都含有 RING 及 WD40結(jié)構(gòu)域(圖12)。此外，這些物種的COP1基因的結(jié)構(gòu)相似，均含有外顯子13個和內(nèi)含子12個(圖13)。綜上，苦蕎 COP1 蛋白與其他植物 COP1 蛋白具有較高的同源性和保守性，表明植物 COP1 蛋白在進化過程中相對保守，由此推測 FtCOP1 可能具有與其他物種 COP1 蛋白相似的功能。

圖11 COP1 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.11 Phylogenetic tree of COP1 protein

圖12 COP1 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與基序Fig.12 Conserved domains and motifs of COP1 protein

圖13 COP1 基因結(jié)構(gòu)Fig.13 Gene structure of COP1

2.4 FtCOP1 基因參與苦蕎芽菜花色苷合成分析

在光照和黑暗條件下培養(yǎng)的苦蕎芽菜在表型上具有明顯的差異，光照下生長的苦蕎芽菜從下胚軸到子葉呈現(xiàn)紅色，而黑暗條件下生長的苦蕎芽菜出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，且胚軸較長(圖14)。光照條件下培養(yǎng)的苦蕎芽菜中積累的花色苷含量遠高于黑暗條件下培養(yǎng)的芽菜，兩者呈極顯著差異(圖15)?；ㄉ蘸铣赏緩缴辖Y(jié)構(gòu)基因在光照培養(yǎng)的苦蕎芽菜中的表達水平也是高于黑暗培養(yǎng)的苦蕎芽菜，顯著差異性(圖16)，而FtCOP1基因的表達水平在黑暗下培養(yǎng)的苦蕎芽菜中高表達，與光照下低表達水平呈現(xiàn)出極顯著差異(圖17)。綜上，F(xiàn)tCOP1基因的表達與花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達水平以及花色苷的積累量呈現(xiàn)負相關，這與之前研究其他物種COP1基因調(diào)控花色苷的結(jié)果一致[21-25]。

CK：光照處理；D：黑暗處理CK: Light treatment; D: Dark treatment圖14 光照和黑暗處理下的苦蕎芽菜Fig.14 Tartary buckwheat sprouts under light and dark treatment

CK：光照處理；D：黑暗處理；** 代表 P<0.01CK: Light treatment; D: Lark treatment; ** represents P<0.01圖15 光照和黑暗處理下的苦蕎芽菜花色苷含量Fig.15 Contents of anthocyanins in tartary buckwheat sprouts under light and dark treatments

CK：光照處理；D：黑暗處理；* 代表 P<0.05CK: Light treatment; D: Dark treatment; * represents P<0.05圖16 光照和黑暗處理下苦蕎芽菜花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達水平Fig.16 Expression levels of anthocyanin biosynthetic structural genes in tartary buckwheat sprouts under light and dark treatments

圖17 光照和黑暗處理下COP1基因在苦蕎芽菜中的表達水平Fig.17 Expression level of COP1 in tartary buckwheat sprouts under light and dark treatments

3 討 論

花色苷的積累量影響著苦蕎芽菜的品質(zhì)和經(jīng)濟效益，探究不同光照條件下，COP1基因影響苦蕎芽菜花色苷含量差異的分子機制有著重要的意義。目前關于COP1基因參與苦蕎花色苷合成的研究較少，克隆苦蕎COP1基因并對其進行結(jié)構(gòu)及功能預測結(jié)果顯示，F(xiàn)tCOP1基因的CDS為2082 bp，編碼681個氨基酸。無信號肽存在，可能含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位在細胞核中，二、三級結(jié)構(gòu)主要元件為無規(guī)卷曲和α螺旋。FtCOP1蛋白在C端和N端分別含有高度保守的RING指區(qū)和WD40重復結(jié)構(gòu)域，表明其具有E3泛素連接酶活性和與轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合的能力，這與其他物種COP1蛋白序列比對結(jié)果相符。在系統(tǒng)進化上FtCOP1蛋白與藜麥COP1蛋白的親緣關系最近。此外，苦蕎與其他植物COP1蛋白的結(jié)構(gòu)、motif及基因結(jié)構(gòu)相似，表明植物COP1蛋白在進化上相對保守，因而可以推測苦蕎具有與擬南芥等其他物種COP1蛋白相似的功能[20,33]。

COP1 是參與花色苷生物合成的負調(diào)控因子[19-25,34]，在擬南芥、蘋果、荔枝 (LitchichinensisSonn.)、藍莓 (Vacciniumcorymbosum) 等物種中已經(jīng)得到證實[21,35-38]。王震[39]發(fā)現(xiàn)與黑暗相比，藍光處理顯著提高苦蕎HY5基因與類黃酮代謝關鍵酶基因表達量，且體內(nèi)外實驗表明FtHY5可以結(jié)合類黃酮代謝通路上CHS2、CHI、F3H等關鍵酶基因啟動子，也可以與調(diào)控類黃酮合成轉(zhuǎn)錄因子FtMYB7互作，正向調(diào)控類黃酮化合物的生物合成。鄧嬌等[40]對FtHY5基因的研究發(fā)現(xiàn)，與黑暗處理相比，正常光照條件下的苦蕎芽有明顯的花色苷積累且FtHY5基因與花色苷合成通路上的結(jié)構(gòu)基因CHS、F3H、DFR和ANS等表達量顯著增加，促進花色苷的積累。本研究中，正常光照處理下苦蕎芽菜出現(xiàn)紅色的花色苷的積累，而黑暗處理下苦蕎芽菜呈現(xiàn)黃化現(xiàn)象，花色苷的合成受到抑制；熒光定量分析結(jié)果表明FtCOP1基因與花色苷合成通路上結(jié)構(gòu)基因的表達呈負相關。Holm等[41]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tHY5蛋白存在與COP1蛋白互作的保守功能域，即核心序列(VPE/DΦG)。本研究保守結(jié)構(gòu)域分析中也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tCOP1蛋白同樣具有與HY5蛋白互作的保守功能域WD40，由此推測苦蕎HY5與COP1蛋白可能具有相互作用的功能?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，可以合理的推測在正常光照下，F(xiàn)tCOP1基因的活性降低，緩解或阻斷對FtHY5轉(zhuǎn)錄因子的泛素化降解過程，F(xiàn)tHY5的活性增強并促使其下游靶基因如CHS、F3H、DFR等表達水平上升，從而促進花色苷的積累；而黑暗條件下，F(xiàn)tCOP1基因的活性增強，靶向HY5轉(zhuǎn)錄因子和其他底物進行泛素化降解，阻止或削弱HY5轉(zhuǎn)錄因子與花色苷合成結(jié)構(gòu)基因如CHS、F3H、DFR啟動子的結(jié)合，從而抑制苦蕎芽菜花色苷的積累。

4 結(jié) 論

FtCOP1基因與花色苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因在黑暗和光照下的表達水平呈相反模式，而結(jié)構(gòu)基因直接調(diào)控花色苷的合成，其轉(zhuǎn)錄水平高低直接與花色苷的積累量呈正相關。推測黑暗下，F(xiàn)tCOP1 因子通過抑制 FtHY5 轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而影響結(jié)構(gòu)基因的表達，抑制苦蕎芽菜花色苷的積累；在光照條件下，F(xiàn)tCOP1 因子的表達水平被限制，活性降低，解除對光形態(tài)建成轉(zhuǎn)錄因子 FtHY5 的抑制，而 FtHY5 在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上都增加，通過促進 MYB 轉(zhuǎn)錄因子的表達間接影響花色苷的積累，或者直接結(jié)合花色苷合成通路上結(jié)構(gòu)基因直接調(diào)控花色苷的生物合成，從而造成光照和黑暗處理下苦蕎芽菜中花色苷含量差異的原因。