劉思景，李 雪，張詠怡，李柳郡，邱 峰，梅曉雯，余佳蓓，秦 笙

急性呼吸道病毒感染 （acute respiratory virus infection）是全球性多發(fā)、常見病之一，較易造成突發(fā)性、流行性傳染??；老年人和兒童發(fā)病率及致死率較高，且目前臨床應(yīng)對重癥呼吸道病毒感染的措施仍極為有限，故在感染初期即對其進行檢出并診斷成為了臨床的迫切需要。病毒培養(yǎng)是世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）提出的檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”，可檢出未知病毒，目前也發(fā)展出離心小瓶和混合細胞培養(yǎng)等快速病毒培養(yǎng)的方法[1]；但由于其培養(yǎng)需用到大量細胞，準(zhǔn)備細胞的步驟和實驗要求較為繁瑣和嚴(yán)格，都是由實驗室各自準(zhǔn)備，沒有統(tǒng)一的質(zhì)量控制和批量生產(chǎn)的條件，因此病毒培養(yǎng)不能廣泛地應(yīng)用于基層單位。為了解決不能批量生產(chǎn)細胞、細胞質(zhì)量不統(tǒng)一、細胞準(zhǔn)備量與臨床標(biāo)本量不符、細胞傳代操作繁瑣等問題，簡化細胞使用流程，筆者對現(xiàn)有的細胞凍存液進行改良，開發(fā)出一種使貼壁狀態(tài)下的細胞直接原位凍存的凍存液并申請了發(fā)明專利（CN201810323244.1）。該凍存液是一種不需對細胞使用胰蛋白酶消化，凍存和復(fù)蘇的步驟不需要離心也可以使得細胞在復(fù)蘇后呈正常生長狀態(tài)的凍存液，極大地簡化了細胞準(zhǔn)備程序，為下一步大批量生產(chǎn)和配送預(yù)制式細胞產(chǎn)品提供良好的凍存介質(zhì)。實驗對該改良凍存液的使用進行初步評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞與病毒

MDCK、LLC-MK2、HEp-2細胞，甲型流感病毒、副流感3型病毒、呼吸道合胞病毒毒株，由廣東省中醫(yī)院檢驗科病毒室提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

丙二醇、甘油、聚乙二醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma，美 國）；胎 牛 血 清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、達氏修正依氏培養(yǎng)液（Dulbecco"s modified Eagle"s medium，DMEM）（Gibco，美國）；呼吸道病毒7項熒光試劑盒 （Diagnostic Hybrids Inc，美國）。

Z2細胞計數(shù)儀（Beckman，美國）；正置熒光顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng)（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 貼壁細胞凍存液制備

將體積比占總體積7.5%DMSO（V/V%）、17.5%丙二醇（V/V%）、2.5%聚乙二醇（V/V%）、10%FBS（V/V%）溶解在DMEM中，經(jīng)無菌過濾后分裝至10 mL離心管中，放置于4℃條件下備用。

1.2.2 常規(guī)凍存液制備

將體積比占總體積10 % DMSO（V/V%）、90 %FBS（V/V%）溶解在DMEM中，經(jīng)無菌過濾后分裝至10 mL離心管中，放置于4℃條件下備用。

1.2.3 細胞凍存與復(fù)蘇

貼壁細胞準(zhǔn)備：收集對數(shù)期MDCK、LLC-MK2、HEp-2細胞，用胰酶消化后調(diào)整細胞懸液濃度至3×105/mL，于96孔板中每孔加細胞懸液100μL，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，獲得單層貼壁細胞。

凍存：取出預(yù)先準(zhǔn)備好的單層貼壁細胞，吸棄96孔板中培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞1次，棄去PBS。貼壁細胞凍存組：每孔加入貼壁細胞凍存液100μL；貼壁細胞凍存對照組：每孔加入常規(guī)凍存液100μL。兩組細胞用封口膜密封，放入異丙醇梯度降溫盒中，密封盒蓋，將降溫盒直接置于-80℃超低溫冰箱。常規(guī)凍存組：用胰酶分別消化3種細胞，把細胞懸液轉(zhuǎn)至離心管，于1 500 r/min條件下離心5 min，棄上清液，加入常規(guī)凍存液；輕柔打散后轉(zhuǎn)至1 mL凍存管，移入降溫盒，置于-80℃超低溫冰箱。常規(guī)凍存組、貼壁細胞凍存對照組和貼壁細胞凍存組凍存7 d后進行復(fù)蘇。

復(fù)蘇：將貼壁細胞凍存組及貼壁細胞凍存對照組96孔板自冰箱中取出，于37℃水浴5～7 min至完全解凍，輕柔吸棄凍存液，加入預(yù)溫的PBS輕柔洗滌細胞，去除殘余凍存液。每孔加入細胞培養(yǎng)液100μL，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。從冰箱中取出常規(guī)凍存組凍存管，放入37℃水浴迅速化凍，化凍后輕柔混勻，將細胞轉(zhuǎn)至含培養(yǎng)液的離心管，于1 500 r/min條件下離心5 min，棄上清液，將沉淀的細胞用培養(yǎng)液重懸后調(diào)整至3×105/mL，于96孔板中每孔加細胞懸液100μL，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，復(fù)蘇的細胞為新鮮貼壁細胞。

1.2.4 HEp-2細胞生長曲線的繪制

各組細胞復(fù)蘇后，連續(xù)培養(yǎng)5 d，每天消化前用PBS洗細胞面2～3次，去除死細胞；用胰酶消化細胞，并用Beckman Z2細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)，記錄實驗結(jié)果。以時間為橫軸、細胞數(shù)為縱軸，繪制生長曲線。

1.2.5 細胞病變法

采 用 細 胞 病 變（cytopathic effect，CPE）法 比 較新鮮貼壁細胞與凍存后貼壁細胞對不同病毒的敏感性。

各組細胞復(fù)蘇后分別感染甲型流感病毒、副流感3型病毒及呼吸道合胞病毒，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，每天在光學(xué)顯微鏡下觀察CPE。

1.2.6 免疫熒光法

采用免疫熒光法比較新鮮細胞與凍存后細胞對不同呼吸道病毒的敏感性。

取各組細胞感染病毒，培養(yǎng)5 d后按照試劑說明書進行免疫熒光染色；在正置熒光顯微鏡下觀察。細胞內(nèi)特異性蘋果綠熒光視為陽性。

2 結(jié)果

2.1 3種細胞凍存后復(fù)蘇細胞形態(tài)比較

在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，3種貼壁細胞凍存組細胞復(fù)溫后細胞狀態(tài)恢復(fù)正常，與常規(guī)凍存組細胞復(fù)蘇培養(yǎng)3 d后的新鮮貼壁細胞形態(tài)基本一致。3種貼壁凍存對照組細胞復(fù)蘇后其細胞大量死亡，數(shù)量急劇減少，細胞間隙增大，細胞呈破碎樣。見圖1。

圖1 3種細胞凍存后復(fù)蘇細胞的細胞形態(tài)比較（100×）Fig.1 Comparison of cell morphology images of resuscitation after cryopreservation in 3 kinds of cells(100×)

2.2 HEp-2細胞生長曲線的繪制

經(jīng)過凍存處理的3組HEp-2細胞復(fù)蘇后，貼壁細胞凍存組細胞密度一直保持5×105/mL水平；常規(guī)凍存組在生長潛伏期（第1天至第3天）細胞密度保持在（2～3）×105/mL水平，指數(shù)生長期內(nèi)（第4天、第5天）升至5×105/mL。貼壁細胞凍存對照組只有極少數(shù)細胞存活。見圖2。

圖2 HEp-2細胞經(jīng)凍存處理后的生長曲線Fig.2 Growth curves of HEp-2 cells after cryopreservation

2.3 凍存后3種復(fù)蘇細胞對不同呼吸道病毒的敏感性CPE法檢測結(jié)果

貼壁細胞凍存組與常規(guī)凍存組的細胞對不同的病毒均呈現(xiàn)典型的CPE，感染了甲型流感病毒、副流感3型病毒的凍存后的貼壁細胞變圓，折光性提高，呈破碎樣CPE，感染呼吸道合胞病毒的凍存后的貼壁 細胞呈巨細胞融合樣CPE（圖3）。

圖3 CPE法比較不同凍存液凍存后3種細胞對不同病毒的敏感性(100×)Fig.3 Comparison of sensitivity images in 3 kinds of cells after different cryopreservation by CPE method(100×)

2.4 凍存后3種復(fù)蘇細胞對不同病毒的敏感性免疫熒光法檢測結(jié)果

貼壁細胞凍存組與常規(guī)凍存組的細胞均出現(xiàn)強的綠色熒光，感染甲型流感病毒的細胞熒光呈胞漿顆粒型或細胞核均質(zhì)型；感染呼吸道合胞病毒的細胞熒光呈胞漿顆粒型，合胞體中亦可見小塊包涵物染熒光；感染副流感3型病毒的細胞熒光呈胞漿顆粒型（圖4）。

圖4 凍存后3種復(fù)蘇細胞對不同病毒的敏感性(100×)Fig.4 Images of sensitivity in 3 resuscitation cells for different viruses after cryopreservation(100×)

3 討論

細胞在慢速凍存過程中將受到多種損傷作用，針對損傷的不同機制，許多研究人員曾提出各種假說。其中最為經(jīng)典的即冰晶物理損傷學(xué)說，在進行了大量有關(guān)冷凍保護劑與冰晶晶格形成的相關(guān)性研究后[2]，此假說可基本得以證實。此外，在冷凍與復(fù)蘇過程中細胞內(nèi)外滲透壓的劇烈變化導(dǎo)致的滲透性休克致傷假說同樣占據(jù)重要地位[2，3]。而近年來的大量研究結(jié)果表明，低溫使細胞膜脂質(zhì)發(fā)生相位變化，導(dǎo)致膜通透性增大，胞內(nèi)成分流失[4~6]，以及細胞在冷凍過程中代謝產(chǎn)生的過量活性氧對細胞膜、蛋白質(zhì)、DNA等各種組分的損傷同樣是細胞凍存過后存活率下降的重要原因[7]。目前通用的細胞凍存方法為細胞單個懸浮凍存；偶見集落凍存，如內(nèi)皮細胞球狀集落凍存[8]；貼壁細胞原位凍存較少報道。Miyamoto Y等[9]曾經(jīng)報道了一種在膠原玻璃凝膠膜上直接原位冷凍保存原代肝細胞和小鼠成纖維細胞的新技術(shù)，可用在即用型細胞的制備工藝中，可滿足實驗需求。Amps KJ等[10]研究了在透氣膜培養(yǎng)盒中原位冷凍保存人胚胎干細胞，該方法能夠原位冷凍保存相對大量的人胚胎干細胞，同時保證了細胞的高產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性，從而擴大了生產(chǎn)規(guī)模并提高效率。以往對凍存液的研究及使用基本是以懸浮細胞或培養(yǎng)物作為對象，與凍存液的接觸面為100%，通常使用10%DMSO即可獲得較好的保護。但在筆者研究中，實驗對象為貼壁細胞，與凍存液的接觸面只有50%，實驗結(jié)果表明常規(guī)的凍存液并不適用于貼壁細胞的原位凍存。筆者研究中選用的DMSO、丙二醇屬于滲透性保護劑，可透過細胞膜滲入細胞內(nèi)，容易結(jié)合水分子，發(fā)生水和作用，使溶液的黏性增加，從而弱化了水的結(jié)晶過程，并降低未結(jié)冰溶液的電解質(zhì)濃度，避免溶質(zhì)損傷；聚乙二醇屬于非滲透性保護劑，可以優(yōu)先同水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，降低冰點，減少冰晶的形成，同時也使電解質(zhì)溶液濃度降低，防止溶質(zhì)損傷。滲透性保護劑與非滲透性保護劑的聯(lián)合使用可達到較好的冷凍前脫水作用，并能有效降低滲透性保護劑的濃度，從而減少其對組織的毒性作用。FBS則通過改變滲透壓，防止冷凍時細胞過度脫水、解凍時細胞發(fā)生滲透性休克，從而保護細胞膜及細胞的完整性[11]。

在感染病毒的實驗中，可見貼壁細胞凍存組各細胞均呈現(xiàn)較為典型的CPE現(xiàn)象。經(jīng)免疫熒光染色后，可見熒光集中分布于胞內(nèi)，胞外病毒顆粒較少，證明病毒成功感染細胞，并在胞內(nèi)大量繁殖。且各實驗組結(jié)果未與常規(guī)凍存組表現(xiàn)出明顯差異性，證明細胞對病毒感染的敏感性未因貼壁凍存而產(chǎn)生明顯影響。

此外，在實驗過程中比值發(fā)現(xiàn)，細胞密度是影響細胞復(fù)蘇后貼壁率及細胞狀態(tài)的重要因素。細胞密度過小，存活率無法保證；而細胞密度過大，復(fù)蘇后的細胞很容易整塊脫落。目前看來80%長滿時狀態(tài)較佳，且鋪板時務(wù)必將細胞吹打均勻，使細胞均勻分布板底。此外，由于3種細胞并非來自同一種屬，生存環(huán)境及生物學(xué)行為不同，因此對凍存環(huán)境的要求具有一定差異性，研究小組將進行更加具有細胞針對性的配方實驗，并繼續(xù)深入探討低溫環(huán)境對不同細胞損傷的具體機制，以及細胞凍融對病毒侵襲的敏感性在細胞器乃至分子層面是否具有影響。

筆者研究的貼壁細胞凍存液是實驗者在長期的工作積累和觀察中，從實際情況出發(fā)對原有材料及其使用范圍進行新的思考和應(yīng)用。貼壁細胞凍存液的開發(fā)可有效降低細胞消化、傳代次數(shù)，簡化細胞準(zhǔn)備程序，滿足臨床對細胞按需取用的要求并避免實驗室浪費的情況出現(xiàn)，同時新的凍存液使用也為下一步大批量生產(chǎn)和配送預(yù)制式細胞產(chǎn)品提供了良好的凍存介質(zhì)。