楊潔容，陳小平

廣東省第二中醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510095

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位［1］。但因卵巢癌致死者占各類婦科腫瘤的首位，是嚴重威脅婦女生命的惡性腫瘤。因卵巢位于盆腔深處，難以捫及或篩查，卵巢癌早期又多無癥狀，70%的卵巢癌在診斷時就已擴散到子宮，雙側(cè)附件，大網(wǎng)膜及盆腔各器官，而且卵巢癌組織類型復雜，所以卵巢癌無論在診斷和治療上都是目前研究的熱點［2,3］。由于卵巢生長在女性盆腔的深部，位置隱蔽，無法直接看到或者觸摸到，并且患者常常無明顯的臨床癥狀，導致80%以上的患者就診時已為晚期，錯過了治療的最佳時期［4］。目前晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為20%～40%，而早期患者卻可以達到70%～90%［5］。

目前納米載體介導的腫瘤光治療，特別是具有代表性的光熱治療（PTT）和光動力治療（PDT）已取得了很大進展［6］。光熱治療（PTT）是近年來被廣泛研究的一種新型腫瘤治療方法，利用具有較高光熱轉(zhuǎn)換效率的材料靶向腫瘤，并在近紅外光（NIR）的照射下將光能轉(zhuǎn)化為熱能，利用癌細胞不耐熱的特性來殺死癌細胞，具有副作用小、操作簡單、治療精準等優(yōu)點［7,8］。PDT是基于光敏劑在腫瘤內(nèi)的局部激活，以誘導化學損傷，從而導致腫瘤細胞死亡［9］；這種方法在臨床上已經(jīng)應用了40多年，用于治療各種癌癥，包括淺表皮膚癌、食道癌和肺癌［10,11］。光熱治療腫瘤短期效果好，光動力治療持續(xù)時間較長［12］。但無論是PTT或者PDT都有其不可避免的缺陷，單模式治療難以徹底根除腫瘤，這仍然是一個尚未解決的重大問題，阻礙了PTT和PDT在臨床上的廣泛應用［13］。而PTT和PDT協(xié)同治療的方法既繼承了光治療毒性低、副作用小的優(yōu)點，又能使兩種治療方式取長補短，是提高療效和減少毒副作用的有效策略。因此，構(gòu)建一種新型PTT/PDT 協(xié)同治療納米藥物體系，對腫瘤后期研究和臨床治療具有重要意義。黑色素及其類似物分布在許多生物中，由于其光吸收特性、光轉(zhuǎn)化和親和性，被廣泛用作無處不在的生物材料。它們是應用于生物成像、光療、抗氧化治療和藥物遞送系統(tǒng)領域的極好的納米載體。此外，值得注意的是，類黑色素（PDA）納米顆粒可以調(diào)節(jié)免疫反應，正如烏賊墨中的納米顆粒介導了M2-TAM 到M1 的復極。因此，黑色素和PDA納米粒子是藥物裝載、光療和免疫激活的合適納米平臺，而PDA納米在卵巢癌腫瘤中的應用尚罕見報道。

在本研究中，我們制備了PDA納米，采用透射電鏡，水合粒徑分析，Zeta電位分析及NIR照射分析其理化表征，同時驗證了其在不同功率NIR照射下誘導卵巢癌細胞氧化應激、增殖轉(zhuǎn)移能力的變化，為PDA納米在卵巢癌中的轉(zhuǎn)化與應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

鹽酸多巴胺（98%）、水合鈉（99%）和聚乙二醇（NH2mPEG-NH2 MW 2000,98%）從廣州淡水有限公司(中國廣州)獲得。去離子(DI)水（18.2 MQcm），從水凈化系統(tǒng)（Synergy,Millipore,MA）獲得，用于所有制備過程。Zeta 電位和流體動力學直徑測量由Zetasizer Nano ZS（Malvern）進行。

1.2 方法

1.2.1 類黑色素納米的制備 將300 mg 鹽酸多巴胺（1.95 mmol，阿拉?。┤芙庠?16 mL去離子水中。在50 ℃溫度下，在劇烈攪拌下，向鹽酸多巴胺溶液中加入1700 μL 的NaOH溶液（1 mol/L）。當溶液顏色變?yōu)榈S色時，向溶液中加入NaOH，并逐漸變?yōu)樯钭厣?。攪? h 后，用離心過濾器（Amicon 離心過濾裝置，MWCO=10 000 Da）進一步離心溶液，并用去離子水滌，重復3次。向5 mL類黑色素水溶液（5 mg/mL水）中加入1 mol/L NaOH 溶液，將溶液的pH調(diào)節(jié)至9。將該混合溶液滴加到25 mg pH=9的NH2-PEG2000-NH2水溶液中。劇烈攪拌8 h后，通過離心過濾器（Amicon 離心過濾器裝置，MWCO=10 000 Da）離心回收PEG修飾的PDA NPs，然后用去離子水洗滌數(shù)次以除去未反應的NH2-PEG2000-NH2。最后，通過冷凍干燥除去水性溶劑，得到聚乙二醇修飾的PDA納米粉末。

1.2.2 PDA納米光熱光動力性能評估 用808 nm波長的激光照射（0.7 W/cm2或1.0 W/cm2,5 min）處理PDA，作為熱探針檢測不同時間點的溫度變化，同時選擇等量的PBS進行相同激光照射作為陰性對照。溫度變化的圖像由紅外成像設（ThermaCAMSC3000,Flir system Incorporation）在0.5 min內(nèi)記錄，共5 min。為了進一步驗證PDT電位，通過DPBF定量分析PDA NPs 在NIR（0.7 W/cm2或1.0 W/cm2,5 min）下產(chǎn)生的活性氧（ROS）產(chǎn)量。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 購買小鼠卵巢癌細胞（ID8，美國型培養(yǎng)物保藏中心），用杜爾貝科改良的Eagle 培養(yǎng)基（DMEM,Gibco）培養(yǎng)，并在37 ℃下添加10%胎牛血清（FBS,Gibco）和抗生素（100 U/mL），在5%CO2中培養(yǎng)。為了準備實驗，將細胞分別接種到6孔板或96孔板中，并與添加有10%FBS的適當DMEM孵育。將制備的細胞暴露于具有10%FBS（Control對照組）、PDA組和PDA加NIR（0.7 W/cm2或1.0 W/cm2,5 min）。

1.2.4 細胞活性氧生成實驗 將ID8細胞接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h（37 ℃，5%CO2）。然后，將細胞分別進行Control、PDA、PDA聯(lián)合NIR（0.7 W/cm2或1.0 W/cm2，5 min）處理后，再次孵育24 h。最后，將細胞與ROS測定試劑盒（中國南京凱根）孵育。

1.2.5 細胞線粒體膜電位實驗 將ID8細胞接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h（37 ℃，5%CO2）。然后，將細胞分別進行Control、PDA、PDA聯(lián)合NIR（0.7 W/cm2或1.0W/cm2，5 min）處理后。再次孵育24 h后，用JC-1檢測試劑盒（中國南京凱根）孵育細胞，JC-1探針孵育后會變成單體JC-1（綠色熒光）跟聚集體JC-1（紅色熒光），而綠色熒光與紅色熒光的比值即可代表線粒體膜電位狀態(tài)。

1.2.6 CCK-8細胞毒性實驗 將ID8細胞接種到96個平板中，在補充有10%FBS的DMEM中培養(yǎng)24 h。隨后，將ID8 分別進行Control、PDA、PDA 聯(lián)合NIR（0.7W/cm2或1.0 W/cm2，5 min）處理后，再次孵育24 h后，用CCK-8測定分析細胞存活率。

1.2.7 Transwell 實驗 將ID8 分別進行Control、PDA、PDA聯(lián)合NIR（0.7W/cm2或1.0 W/cm2，5 min）處理后，重新消化懸浮ID8細胞（2×105）并種植在直徑8.0 μm的聚碳酸酯Costar?Transwell?兩室移行板（康寧）的上室中。將介質(zhì)（600 μL）加入6孔板的下層隔間。孵育24 h后，對下室細胞進行計數(shù)，評價細胞的侵襲和遷移能力。

1.2.8 類黑色素納米顆粒的體內(nèi)抗腫瘤效應 將ID8卵巢癌細胞注射于構(gòu)建小鼠皮下單側(cè)構(gòu)建荷瘤模型，予尾靜脈注射類黑色素納米顆粒24 h后用NIR（0.7 W/cm2）照射單側(cè)皮下腫瘤，連續(xù)記錄小鼠瘤體體積并繪制生長曲線；2周后，用戊巴比妥對小鼠實施安樂死，對腫瘤組織進行稱重及體積測量。

1.2.9 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 20.0處理。計數(shù)資料組間比較則采用卡方檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存分析，并用Log-rank檢驗比較組間差異。以α=0.05為檢驗標準，對以上結(jié)果均進行雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 類黑色素納米顆粒的理化表征

本實驗成功制備PDA-PEG納米顆粒。透射電鏡圖所示：PDA-PEG納米為約100 nm大小的圓球顆粒（圖1A）。經(jīng)由馬爾文粒徑儀數(shù)據(jù)所示：PDA-PEG納米復合物粒徑為100±5 nm，其平均Zeta電位分別為-20±2.1 mⅤ（圖1B、C）。

圖1 PDA-PEG納米的理化表征Fig.1 Characterization of PDA-PEG nanoparticles.A: Transmission electron microscopic images of PDA-PEG nanoparticles (Scale bar=50 nm).B: Particle size of PDA-PEG nanoparticles.C: Surface charge of PDA-PEG nanoparticles.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.2 類黑色素納米顆粒的光熱光動力性能

本研究利用近紅外激發(fā)光（808 nm）對PDA-PEG納米溶液進行激發(fā)，通過對溫度曲線分析發(fā)現(xiàn)：相比于磷酸鹽緩沖液（PBS，空白對照組），PDA-PEG納米復合物在0.7 W/cm2以及1.0 W/cm2功率下的溶液溫度呈先快速增高，后續(xù)緩慢升高趨勢，其變化溫度值（ΔT）分別約為15 ℃與30 ℃，顯示出良好的光熱性能（圖2A）。通過單線氧生成曲線分析發(fā)現(xiàn)：相比于PBS（空白對照組），PDA-PEG納米復合物在0.7 W/cm2以及1.0 W/cm2功率下均可見大量單線氧生成，且功率越大，活性氧生成越多（圖2B）。

圖2 PDA-PEG納米的光熱光動力性能Fig.2 Photothermal and photodynamic performance of PDA-PEG nanoparticles.A:Temperature curve generated by PDA-PEG nanoparticles and PBS in response to NIR irradiation at 0.7 and 1.0 W/cm2.B:Curve of singlet oxygen generation by PDA-PEG nanoparticles and PBS under NIR irradiation at 0.7 and 1.0 W/cm2.

2.3 類黑色素納米顆粒可誘發(fā)卵巢癌細胞內(nèi)活性氧生成

基于PDA-PEG納米優(yōu)良的光熱光動力效應，我們進一步其在細胞內(nèi)誘導氧化應激的能力。流式細胞學實驗分析結(jié)果提示：相比于空白對照組，單純材料組（PDA）不會引起細胞內(nèi)活性氧（綠色熒光）生成，而PDA聯(lián)合近紅外光照射能顯著提高ID8卵巢癌細胞內(nèi)的活性氧（綠色熒光）生成能力（圖3，P＜0.001）。與此同時，相比較于低功率近紅外（0.7 W/cm2）光照組，高功率近紅外（1.0 W/cm2）處理的細胞內(nèi)活性氧（綠色熒光）水平更高（圖3，P＜0.001）。

圖3 PDA-PEG納米的活性氧生成能力Fig.3 Ability of PDA-PEG nanoparticles for inducing reactive oxygen species(ROS)production.Flow cytometry was used for quantitative analysis of ROS production in ID8 cells following NIR irradiation at 0.7 or 1.0 W/cm2 for 5 mins.***P＜0.001.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.4 類黑色素納米顆粒可誘發(fā)卵巢癌細胞內(nèi)線粒體膜電位失衡

流式細胞學實驗分析結(jié)果提示：相比于空白對照組（control），單純材料組（PDA）不會引起細胞內(nèi)線粒體膜電位下降，而PDA聯(lián)合近紅外光照射能顯著降低ID8卵巢癌細胞內(nèi)的線粒體膜電位（紅色熒光/綠色熒光；圖4，P＜0.001）。與此同時，相比較于低功率近紅外（0.7 W/cm2）光照組，高功率近紅外光照（1.0 W/cm2）的細胞線粒體膜電位水平更低下（紅色熒光/綠色熒光；圖4，P＜0.01）。

圖4 PDA-PEG納米誘導線粒體損傷的能力Fig.4 Flow cytometry for analyzing the ability of PDA-PEG nanoparticles for inducing mitochondria damage in ID8 cells with NIR irradiation at 0.7 or 1.0 W/cm2 for 5 mins.**P＜0.01,***P＜0.001.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.5 類黑色素納米顆?？烧T導卵巢癌細胞死亡

CCK8實驗（圖5）表明：相比于純材料（PDA）組，PDA聯(lián)合近紅外光照射能顯著抑制ID8卵巢癌細胞的存活率（P＜0.001）。與此同時，相比較于低功率近紅外（0.7 W/cm2）光照組，高功率近紅外（1.0W/cm2）光照處理的腫瘤細胞死亡率更高（P＜0.001）。

圖5 通過CCK-8檢測經(jīng)PDA-PEG納米聯(lián)合近紅外光誘導ID8 細胞死亡的能力Fig.5 ID8 cell death induced by PDA-PEG nanoparticles and NIR irradiation detected by CCK-8 assay.***P＜0.001.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.6 類黑色素納米顆?？梢种坡殉舶┘毎D(zhuǎn)移能力

Transwell細胞轉(zhuǎn)移試驗分析結(jié)果提示：相比于空白對照組，PDA 不會引起細胞的遷移能力的顯著改變，而PDA 聯(lián)合近紅外光照射能顯著抑制ID8 卵巢癌細胞的遷移能力（圖6A、B，P＜0.001）。與此同時，相比較于低功率近紅外（0.7 W/cm2）光照組，高功率近紅外（1.0 W/cm2）照射后ID8 的遷移細胞數(shù)目下降更明顯（圖6A、B，P＜0.001）。

而Transwell細胞轉(zhuǎn)移試驗分析結(jié)果亦提示：相比于空白對照組，PDA不會引起細胞的侵襲能力的顯著改變，而PDA聯(lián)合近紅外光照射能顯著抑制ID8卵巢癌細胞的侵襲能力（圖6C、D，P＜0.001）。與此同時，相比較于低功率近紅外（0.7 W/cm2）光照組，高功率近紅外（1.0 W/cm2）照射后ID8的侵襲細胞數(shù)目下降更明顯（圖6C、D，P＜0.001）。

圖6 PDA-PEG納米聯(lián)合近紅外光抑制ID8卵巢癌細胞遷移與侵襲的能力Fig.6 PDA-PEG nanoparticles plus NIR irradiation(0.7 W/cm2 or 1.0 W/cm2 for 5 min)suppress migration and invasion of ID8 cells.A,B:Transwell assay for analyzing ID8 cell migration(Original magnification: ×200).C,D:Transwell assay for analyzing ID8 cell invasion(×200).**P＜0.01,***P＜0.001.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.7 類黑色素納米顆粒的體內(nèi)抗腫瘤效應

相對于生理鹽水處理組，單純的類黑色素納米顆粒組沒有顯著抑制腫瘤生長，而PDA聯(lián)合近紅外光照射對腫瘤的抑制率高達70%（圖7）。

圖7 PDA-PEG納米體內(nèi)抗腫瘤作用Fig.7 Anti-tumor effect of PDA-PEG nanoparticles in mice.A:The tumors in mice treated with PDA-PEG+NIR.B:Volume of the tumors dissected from the mice.Data are shown as Mean±SD(n=4).*P＜0.001 vs control.

3 討論

目前，針對新發(fā)卵巢癌患者，較為常用的治療方法依然是手術(shù)和化療相結(jié)合。根治性手術(shù)和化療策略的關鍵進展提升了患者生存周期［13］。但卵巢癌依然存在較高的復發(fā)及治療不佳患者。為了最大化地改善卵巢癌患者的預后，臨床上一直在探索如何優(yōu)化治療方法，為患者提供更有效更經(jīng)濟的綜合治療方案。

近年來，基于近紅外的光療結(jié)合化療，由于其精確的腫瘤定位、高效的消融能力和更好的生物相容性而被開發(fā)為一種理想的治療策略［14］。腫瘤的光療主要包括光熱治療（PTT）和光動力治療（PDT）。對于光熱治療來說，在特定波長下的光照射光熱劑，使得光熱劑升溫從而殺死腫瘤細胞［15］；而對于光動力治療來說，在特定的光照射下，光敏劑可以產(chǎn)生大量的活性氧自由基（ROS）從而可以殺死腫瘤細胞［16］。PDT還具有治療其他腫瘤類型的潛力，有針對乳腺癌、頭頸癌、膽管癌、膀胱癌、胰腺癌、宮頸癌的臨床試驗的支持性證據(jù)［17-20］。PTT可用于提高局部光加熱和腫瘤組織消融的效率，但尚未在大型臨床試驗中進行測試；無PTT試劑的激光消融已在臨床上使用［21］，并且隨著光熱治療的不斷深入研究，細胞自身產(chǎn)生的熱休克現(xiàn)象嚴重限制了光熱治療效率，單獨使用PTT或PDT很難完全根除實體瘤［22］。因此，PTT和/或PDT與其他治療方式的結(jié)合可以提供利用每種治療方式的優(yōu)點，從而產(chǎn)生附加的甚至是協(xié)同的治療效果。天然黑色素有光吸收特性、抗腫瘤特性等突出優(yōu)點［23］，但由于天然黑色素會與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，且難溶于有機溶劑和水［24］。近年來科學家們重點研究人工合成類黑色素，它們有著和天然黑色素相同的光學性質(zhì)，因為其易合成的特點，現(xiàn)在也成為光熱劑的熱門材料［25］。本文研究的PDA作為類黑色素之一，它是一種光熱性能良好的光熱劑，它能夠吸收光能高效地將其轉(zhuǎn)化為熱能,使腫瘤局部升溫至45 ℃以上，進而殺死癌細胞，這種特性使PDA 在光熱治療方面有著較為良好的應用［26,27］。PDA具有超強的附著力，可粘附于各種材料的表面，對于其他材料進行修飾，而且PDA表面也存在大量的-OH基團，可以和其他金屬離子反應［28］，例如與Gd3+形成配位化合物，從而增強其載藥或生物成像方面的特性［29］；同時據(jù)研究報道，Li等［30］發(fā)現(xiàn)，具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸（RGDC）功能并負載DOX的PDA可以有效地釋放并誘導化學光熱效應，產(chǎn)生顯著的抗腫瘤效應；Liu等［31］證明天然黑色素納米粒結(jié)合光熱光動力學效應可以誘導腫瘤免疫原性細胞死亡，成功構(gòu)建PDA包被的納米顆粒用于靶向癌癥治療，由于PDA層的覆蓋，他們的納米藥物能在近紅外光激光照射下具有出色的光熱轉(zhuǎn)換能力，有機地結(jié)合了化療盒光熱療法。因此，基于類黑色素優(yōu)異的紫外線吸收效果、高效的自由基捕獲能力以及表面帶有的多種官能團，已被證明在腫瘤中具有良好的光熱光動力效應，能產(chǎn)生良好的抗腫瘤作用。相比之下，本研究的納米粒結(jié)構(gòu)制備方法簡易，充分利用了NIR與光熱劑PDA的結(jié)合，為進一步增加其水溶性，對其進行聚乙二醇（PEG）修飾，我們的研究結(jié)果證明類黑色素納米與近紅外光聯(lián)合應用可產(chǎn)生比單純類黑色素納米治療更好的療效。

綜上，本研究成功合成了類黑色素，通過透射電鏡，水合粒徑，Zeta電位的研究分析表明，類黑色素被成功制備。同時，通過體外功能驗證，證明其具有良好的光熱光動力學效應。進而通過細胞實驗表明其可以引起細胞活性氧升高，并從體內(nèi)外實驗中驗證其抗高效的腫瘤效應。此研究為卵巢癌的非手術(shù)治療提供了一種潛在的思路和手段。