周 琴，劉 健，孫艷秋，陳曉露，張先恒，丁 香

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230012

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患病率高達(dá)1%［1］，其主要表現(xiàn)為對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎，是一種常見的自身免疫性關(guān)節(jié)炎。在RA的病理變化過程中，越來越多的證據(jù)證明，滑膜成纖維細(xì)胞（FLS）起著關(guān)鍵的作用。RA-FLS具有包括細(xì)胞增殖的增加、大量促炎細(xì)胞因子的分泌，以及促進(jìn)遷移等的腫瘤樣特性，進(jìn)而引起局部和全身炎癥［2-4］。RA以其病程長，不可治愈、病情難愈，并且在疾病發(fā)展過程會(huì)有致殘的風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn)，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，伴隨著不同程度的患者感受（SPP）的改變，在臨床研究中患者感受和疾病的發(fā)展、藥物的干預(yù)作用的關(guān)聯(lián)越來越受關(guān)注［5,6］。

在RA 的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制中miRNAs 起著關(guān)鍵作用［7-9］。作為miR-342 家族中的一員，miR-342-3p是定位于14 號(hào)染色體14q32 上的一段非編碼序列，位于宿主基因EⅤL 的第3 個(gè)內(nèi)含子中［10,11］。目前國內(nèi)外關(guān)于miR-342-3p在RA中研究不多，既往僅有少量研究報(bào)道m(xù)iR-342-3p的異常表達(dá)可能與RA的免疫炎癥相關(guān)［12］，但未見與RA 患者臨床指標(biāo)相關(guān)分析。本研究關(guān)聯(lián)規(guī)則分析miR-342-3p與RA患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性，并納入患者感受指標(biāo)，研究miR-342-3p 的表達(dá)與焦慮抑郁指標(biāo)的相關(guān)性，及探索其對(duì)滑膜細(xì)胞炎癥和遷移的影響。

本研究旨在觀察miR-342-3p在RA患者中的表達(dá)，分析其與臨床指標(biāo)、患者感受的相關(guān)性，然后通過體外培養(yǎng)RA-FLS，探究miR-342-3p干擾或過表達(dá)狀態(tài)下對(duì)RA-FLS炎癥和遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 病例來源

50例RA患者來自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院患者（2021年3月～2022年6月），其中男性9 例，女性41 例，年齡52（48，65.25）歲；病程為7（2.75,17.25），30例正常對(duì)照者（HC）來自同一時(shí)間安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康體檢中心，其中男性3例，女性27例，年齡53（47.75，61.25）歲，兩組基線比較一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。本研究經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院科學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019AH-12）。

表1 兩組受試者一般情況Tab.1 General information of subjects in the two groups

1.2 診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)聯(lián)合歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）提出的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡在18～70歲之間；（3）所有患者均簽署知情同意書。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）合并有心、肝、腎等嚴(yán)重疾病的患者；（3）年齡在18歲以下，70歲以上者；（4）孕婦或正值哺乳期的女性；（5）觀察期間應(yīng)用生物制劑的患者；（6）關(guān)節(jié)嚴(yán)重畸形，完全喪失關(guān)節(jié)功能的患者；（7）合并有精神病，不能配合治療的患者。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 免疫炎癥指標(biāo) 類風(fēng)濕因子（RF），抗環(huán)瓜氨酸肽抗體IgG（anti-CCP），血沉（ESR），超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP），免疫球蛋白A（IgA），免疫球蛋白G（IgG），免疫球蛋白（IgM），補(bǔ)體C3（C3），補(bǔ)體C4（C4）。

1.3.2 患者感受指標(biāo) 28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分（DAS-28）、焦慮自評(píng)量表（SAS），抑郁自評(píng)量表（SDS）。

1.4 RA-FLS培養(yǎng)

將培養(yǎng)的RA患者滑膜成纖維細(xì)胞[賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司]用PBS洗2次，在37 ℃的溫度下，加入1 mL胰酶，顯微鏡下觀察到細(xì)胞明顯收縮，變圓后，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，移液槍吹打，使細(xì)胞脫落，收集細(xì)胞至15 mL離心管，以1000 r/min的轉(zhuǎn)速，超速離心5 min，再棄上清，加入適量新鮮DMEM培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并收集備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長的傳代培養(yǎng)的RA-FLS細(xì)胞鋪板在六孔板里面，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行如下分組的處理：（1）RA-FLS 組：細(xì)胞不做任何處理；（2）TNF-α+RA-FLS組：20 ng/mL TNF-α刺激細(xì)胞24 h；（3）TNF-α+RAFLS+mimics-NC：20 ng/mL TNF-α刺激細(xì)胞24 h后轉(zhuǎn)染mimics-NC 48 h；（4）TNF-α+RA-FLS+mimics-miR-342-3p：20 ng/mL TNF-α刺激細(xì)胞24h后轉(zhuǎn)染mimics-NC 48 h；（5）TNF-α+RA-FLS+inhibitor-NC：20 ng/mL TNF-α刺激細(xì)胞24 h后轉(zhuǎn)染inhibitor-NC 48 h；（6）TNFα+RA-FLS+inhibitor-miR-342-3p組：20 ng/mL TNF-α刺激細(xì)胞24 h后轉(zhuǎn)染si-miR-342-3p 48 h。根據(jù)制造商的說明，將mimics-miR-342-3p、inhibitor-miR-342-3p與各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至RA-FLS中，繼續(xù)孵育48 h。

其中mimics-miR-342-3p、inhibitor-miR-342-3p與各自陰性對(duì)照購自上海GenePharma。

1.6 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone）；Transwell 小室（Millicell）；胎牛血清（浙江天杭生物公司）；二甲基亞砜（Sigma）；ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技公司）；PBS（BI）；超凈工作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司），熒光定量PCR 儀（Thermo Scientific），培養(yǎng)箱（Thermo），普通PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）；熒光顯微鏡(Motic)等。

1.7 實(shí)驗(yàn)方法

1.7.1 RT-qPCR檢測miR-342-3p的表達(dá) 收集外周血單個(gè)核細(xì)胞、RA-FLS做RT-qPCR檢測，Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳，再采用Gelpro32 凝膠圖像分析軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，以U6表達(dá)量為參照采用2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析（表2）。

表2 RT-qPCR定量分析miR-342-3p引物Tab.2 Primers for RT-qPCR amplification of miR-342-3p and U6

1.7.2 ELISA 檢測 采用ELISA 方法，收集以上各組RA-FLS 培養(yǎng)的上清液，以2000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心20 min，再棄沉淀。將上清液加入酶標(biāo)板中，37 ℃溫度下孵育1.5 h，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測介素（IL）-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的表達(dá)。

1.7.3 CCK8檢測RA-FLS細(xì)胞活力 將RA-FLS細(xì)胞接種到96孔板中并培養(yǎng)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中分別孵育0、24、48 h，每孔加入10 μLCCK-8溶液，避免氣泡生成，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

1.7.4 Transwell檢測RA-FLS細(xì)胞遷移 在37 ℃和5%CO2條件下，將transwell小室放入培養(yǎng)板中，將RA-FLS細(xì)胞消化后，洗滌、重懸，取100 μL細(xì)胞懸液置于上室，下室盛裝800 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，以聚碳酸酯膜相隔，培養(yǎng)48 h，加入PBS緩沖液，固定、結(jié)晶紫染色，隨機(jī)取3個(gè)視野。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布，則采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；不符合正態(tài)分布，則采用秩和檢驗(yàn)，并采用四分位數(shù)間距表示。多組數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOⅤA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者的臨床特征

RA患者的DAS28評(píng)分為4.80（4.20，5.40）分，SAS評(píng)分為48.75（35，62.75）分，SDS 評(píng)分為58.75（53.75，67.50）分。與健康對(duì)照組（HC）對(duì)比，RA患者免疫炎癥指標(biāo)RF、ESR、anti-CCP、hs-CRP均顯著升高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而兩組IgA、IgG無明顯差異，IgM、C3、C4差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表3 受試者臨床指標(biāo)特征Tab.3 Clinical data and SPP of RApatients

2.2 MiR-342-3p在RA患者中的表達(dá)

與正常組相比，miR-342-3p在RA患者PBMCs中表達(dá)顯著降低（圖1A）；ROC曲線結(jié)果顯示，曲線下面積為97.53%（P＜0.0001），95%的置信區(qū)間為0.9495～1，其中精確度為96.67%，靈敏度為86%，Cut-off 值為0.535（圖1B），說明miR-342-3p可作為RA協(xié)助診斷標(biāo)志物。

圖1 MiR-342-3p在RA患者中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-342-3p the PBMCs of RA patients.A:Expression of miR-342-3p in PBMCs of healthy controls and RApatients detected by qRT-PCR.B:ROC curve.***P＜0.01.

2.3 MiR-342-3p與RA患者免疫炎癥指標(biāo)及患者感受指標(biāo)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RA患者miR-342-3p與RF（r=-0.321）、ESR（r=-0.284）、anti-CCP（r=-0.355）、hs-CRP（r=-0.320）、C3（r=-0.294）、DAS-28（r=-0.395）、SAS（r=-0.366）、SDS（r=-0.397）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05，圖2）。

圖2 MiR-342-3p與RA患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of miR-342-3p and clinical indicators in RApatients.

2.4 MiR-342-3p與RA患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果顯示，miR-342-3p的降低與RA患者anti-CCP、DAS-28、SDS、SAS的升高有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，規(guī)則支持均大于85%、置信度均大于88%和提升均大于1（表4）。

表4 MiR-342-3p與RA患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Tab.4 Analysis of association rules between miR-342-3p and clinical indicators in RApatients

2.5 MiR-342-3p對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力的影響

通過qRT-PCR檢測miR-342-3p的表達(dá)，我們成功轉(zhuǎn)染了mimics-miR-342-3p或inhibitor-miR-342-3p在RA-FLS中（圖3A）。為了探討miR-342-3p對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的RA-FLS的影響，使用CCK8檢測RA-FLS的細(xì)胞活力，與RA-FLS組對(duì)比，TNF-α刺激后RA-FLS細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）；與mimics-NC 組相比，mimicsmiR-342-3p組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與inhibitor-NC組相比，inhibitor-miR-342-3p組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）；并且24h時(shí)細(xì)胞活力變化最明顯（圖3B）。

圖3 MiR-342-3P對(duì)細(xì)胞活力的影響.Fig.3 Effect of modulation of miR-342-3p expression levels on viability of cultured RA-FLS.A:Verification of miR-342-3p expression in RA-FLS after transfection using qRT-PCR.B:CCK8 assay for assessing cell viability at 0,24,and 48 h after transfection.*P＜0.05 vs blank control group;#P＜0.05 vs mimics-NC group,P＜0.05;and^P＜0.05 vs inhibitor-NC group.

2.6 MiR-342-3p對(duì)RA患者PBMCs中細(xì)胞因子表達(dá)的影響

與RA-FLS 組對(duì)比，TNF-α刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)顯著升高，IL-10的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與mimics-NC 組相比，mimics-miR-342-3p 組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)顯著降低，IL-10 的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與inhibitor-NC組相比，inhibitor-miR-342-3p組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)顯著升高，IL-10的表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 MiR-342-3p對(duì)細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effect of modulation of miR-342-3p expression levels on production of IL-1β(A),IL-6(B),IL-10(C)and TNF-α(D)in cultured RA-FLS.*P＜0.05 vs RA-FLS;#P＜0.05 vs mimics-NC;^P＜0.05 vs inhibitor.

2.7 MiR-342-3p對(duì)RA患者滑膜細(xì)胞遷移的影響

采用Transwell檢測細(xì)胞遷移功能，采用0.1%結(jié)晶紫染色，結(jié)果顯示，與RA-FLS相比，TNF-α刺激后，細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與mimics-NC 組相比，mimics-miR-342-3p組細(xì)胞遷移能力顯著減弱（P＜0.05）；與inhibitor-NC組相比，inhibitor-miR-342-3p組細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05，圖5）。

圖5 MiR-342-3p對(duì)RA患者滑膜細(xì)胞遷移的影響Fig.5 Effect of modulation of miR-342-3p expression levels on migration of RA-FLS(crystal violet staining).

3 討論

在RA的發(fā)病過程中始終伴隨著炎性細(xì)胞的浸潤，F(xiàn)LS是滑膜細(xì)胞的主要組成部分，是滑膜關(guān)節(jié)的間充質(zhì)細(xì)胞［12］，是一種炎性細(xì)胞，F(xiàn)LS在RA中過度激活，分泌大量炎性細(xì)胞因子，加重疾病的發(fā)展［13］。炎性信號(hào)的刺激可以使FLS異常增殖、凋亡不足，從而產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β等，產(chǎn)生的炎性因子反過來又不斷地激活FLS，兩者相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)［14,15］。

歐曼穎等［16］發(fā)現(xiàn)，miR-342-3p上調(diào)后，子癇前期的胎盤組織中滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和遷移等能力明顯降低。朱亞蕊等［17］發(fā)現(xiàn)，miR-342-3p在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，通過過表達(dá)進(jìn)而影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移等。本研究以miR-342-3p 為研究對(duì)象，通過35 例RA患者和30例正常對(duì)照組的小樣本的臨床驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-342-3p 在RA 患者PBMCs 中表達(dá)顯著降低（P＜0.05），ROC 曲線結(jié)果表明，miR-342-3p 的AUC 為84.76%，說明miR-342-3p具有潛在診斷價(jià)值；有研究發(fā)現(xiàn)［11,18-21］miR-342-3p在鼻咽癌細(xì)胞和組織中、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、自身免疫性肝炎等均呈低表達(dá)狀態(tài)，miR-342-3p 低表達(dá)與乳腺癌內(nèi)分泌治療的耐藥性相關(guān)。miR-342-3p在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟中起著至關(guān)重要的作用。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RA患者miR-342-3p與炎癥指標(biāo)：RF、ESR、anti-CCP、hs-CRP、C3及患者感受指標(biāo)：DAS-28、SAS、SDS具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）；關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果表明，miR-342-3p與炎癥指標(biāo)：anti-CCP，及患者感受指標(biāo)：DAS-28、SDS、SAS具有較高的規(guī)則支持、置信度和提升。有研究發(fā)現(xiàn)抑郁、焦慮、慢性疼痛和阿片類藥物使用在炎癥性關(guān)節(jié)炎患者中很常見［22］。Cozad Melanie等［23］通過對(duì)15名診斷為RA的患者的隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，RA患者伴有不同程度的消極情緒。本研究發(fā)現(xiàn)RA患者不僅伴有免疫炎癥的異常，還會(huì)有一定程度的焦慮抑郁，而這些患者感受指標(biāo)的升高與miR-342-3p的降低有一定的相關(guān)性及關(guān)聯(lián)性。

研究結(jié)果顯示，對(duì)RA-FLS 的刺激以20 ng/mL濃度的TNF-α在24 h最佳，經(jīng)TNF-α 刺激后，細(xì)胞活力顯著上升，同時(shí)促進(jìn)了促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)，并抑制了IL-10的表達(dá)，及滑膜細(xì)胞的遷移。為了進(jìn)一步探究miR-342-3p在RA中發(fā)揮的潛在機(jī)制作用，我們?cè)赗A-FLS中進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，以TNF-α+RA-FLS為模型。通過構(gòu)建miR-342-3p的過表達(dá)質(zhì)粒和小干擾RNA，轉(zhuǎn)染至FLS中，inhibitor-miR-342-3p組miR-342-3p表達(dá)顯著降低，mimics-miR-342-3p組miR-342-3p表達(dá)顯著升高（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染成功。ELISA 結(jié)果顯示，inhibitor-miR-342-3p組促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)顯著升高、抑炎因子IL-10表達(dá)下降，mimics-miR-342-3p組促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)顯著下降，抑炎因子IL-10表達(dá)上升（P＜0.05）。此外，我們采用transwell小室檢測的細(xì)胞的遷移，發(fā)現(xiàn)mimics-miR-342-3p組細(xì)胞遷移能力顯著減弱，而inhibitor-miR-342-3p組細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），說明miR-342-3p對(duì)滑膜細(xì)胞的遷移有一定的抑制作用，并且有研究表明［24-26］，miR-342通過調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞死亡來控制結(jié)核分枝桿菌的易感性。通過靶向MAP1LC3B抑制促生存自噬和通過腫瘤抑制基因去甲基化和再表達(dá)下調(diào)DNMT1來介導(dǎo)對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的抑制作用；過表達(dá)miR-342-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲有一定的抑制作用。

綜上所述，本研究表明，miR-342-3p在RA患者中低表達(dá)，與免疫炎癥指標(biāo)、SPP具有顯著相關(guān)性，及較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。MiR-342-3p是參與RA發(fā)病的重要miRNA，通過調(diào)控RA-FLS炎癥以及遷移，參與RA的發(fā)病機(jī)制，可作為RA潛在診斷靶點(diǎn)。