溫海飛，黃顯瑩

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515

胃癌（GC）全球每年新發(fā)病例數(shù)超百萬(wàn)，而其中中國(guó)患者約占半數(shù)［1,2］。我國(guó)80%胃癌患者在確診時(shí)已是進(jìn)展期以及晚期［3］，針對(duì)此類患者而言，以鉑類和氟尿嘧啶類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是首選的一線治療方案。盡管其研究工作取得了重大的進(jìn)展，但傳統(tǒng)輔助化療治療選擇仍然有限、毒副作用大，目前總體5年生存率不足50%［4］。尋找一種既能提高療效又能避免傳統(tǒng)輔助化療帶來(lái)的毒副作用的新型治療方案，是目前突破胃癌治療瓶頸的關(guān)鍵。

光熱療法（PTT）是利用近紅外光（NIR）的光熱轉(zhuǎn)換作用，在無(wú)創(chuàng)的情況下通過(guò)熱效應(yīng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡［5］。NIR不僅可以直接引起腫瘤細(xì)胞死亡，同時(shí)可更為精準(zhǔn)地促進(jìn)藥物的釋放［6］。除此以外，研究證實(shí)在低于42 ℃的條件下進(jìn)行熱療可增加腫瘤區(qū)域的血流灌注，從而提高藥物的有效濃度、增強(qiáng)藥物的細(xì)胞毒性［7,8］。光熱療法與化療相結(jié)合有望成為一種新型、有效的胃癌治療方案。銅基金屬納米材料，如銅納米顆粒（Cu NPs）、硫化銅（CuS）、硒化銅（Cu2Se）、氧化銅（CuO）等，其光熱轉(zhuǎn)換率高，介導(dǎo)的類芬頓反應(yīng)可催化腫瘤微環(huán)境（TME）中的過(guò)氧化氫（H2O2）產(chǎn)生過(guò)量的羥自由基（?OH），從而重塑腫瘤相關(guān)微環(huán)境、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡［9-11］，在乳腺癌、前列腺癌、惡性胸膜間皮瘤等治療中取得了一定的療效［12］。其中氧化亞銅（Cu2O）作為一種穩(wěn)定的銅基納米藥物，在黑色素細(xì)胞瘤、膀胱癌、宮頸癌細(xì)胞系中已被證實(shí)可通過(guò)產(chǎn)生活性氧（ROS）促進(jìn)相關(guān)的腫瘤細(xì)胞凋亡［13-15］，但其用于胃癌的治療卻鮮有報(bào)道?；诖耍狙芯恐苽淞薈u2O，探索了其物化表征以及在胃癌細(xì)胞系中的抗腫瘤效應(yīng)，旨在初步探索Cu2O是否可通過(guò)光熱/化學(xué)動(dòng)力協(xié)同作用在胃癌中起到療效。

1 材料和方法

1.1 Cu2O納米顆粒的合成

85 mg二水氯化銅（CuCl2-2H2O）與300 mg 聚乙烯吡咯烷酮（PⅤP，MW=6000）放在20 mL去離子水中以600 r/min攪拌1 h，隨后加入320 mg NaOH攪拌溶解。將上述溶液置入氮?dú)猸h(huán)境，逐漸加入176 mg抗壞血酸繼續(xù)1000 r/min攪拌1 h。經(jīng)過(guò)去離子水以10 000 r/min反復(fù)洗滌，離心3次，隨后在50 ℃真空干燥24 h后，得到30 mg氧化亞銅（Cu2O）。

1.2 Cu2O納米顆粒的形態(tài)大小

收集Cu2O納米并適當(dāng)稀釋樣品溶液后，用移液槍吸取10 μL樣品滴加在鎳網(wǎng)上。室溫放置至溶液蒸發(fā)后，用離子濺射儀鍍上導(dǎo)電金膜，在200 kⅤ的加速電壓下，采用TEM觀察納米復(fù)合物的形貌特征（JeolJem-2100f TEM透射電鏡儀），并利用動(dòng)態(tài)光散射原理測(cè)定Cu2O納米顆粒的粒徑和電勢(shì)。

1.3 Cu2O納米顆粒的光熱功能

收集成功合成的Cu2O納米，并按一定比例進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，取不同濃度（20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL）的200 μL稀釋后的溶液加入到1.5 mL的EP管中（其中PBS作為陰性對(duì)照）。將樣品及激光儀（LR-MFJ-1064/5000；Bruke）固定后，打開(kāi)近紅外（808 nm）激光儀光源對(duì)樣品進(jìn)行照射（0.5 W/cm2，5 min），并通過(guò)紅外探測(cè)儀（Tensor 27 FT IR spectrometer;Bruke）進(jìn)行拍照分析溫度變化水平，繪制升溫曲線。

1.4 Cu2O納米顆粒的化學(xué)動(dòng)力功能

利用選擇性?OH捕獲后亞甲基藍(lán)（MB）降解的經(jīng)典比色法，在PBS（pH=6.5）中加入4 mmol/LH2O2的MB溶液（10 μg/mL），在不同溫度條件下（37 ℃和45 ℃），加入不同濃度的Cu2O 納米顆粒（0、20、40、60 μg/mL），檢測(cè)其λ=664 nm 的吸光度，用于檢測(cè)不同濃度材料的?OH生成量，即類芬頓效果。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行胃癌細(xì)胞（AGS 及MKN45）培養(yǎng)。每24 h更換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞密度超過(guò)70%時(shí)，以0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.6 激光共聚焦實(shí)驗(yàn)

將胃癌細(xì)胞（AGS及MKN45）鋪板于細(xì)胞培養(yǎng)板貼壁后，在每個(gè)微孔中加入不同濃度的Cu2O納米進(jìn)行孵育，并進(jìn)行光照或者非光照處理，繼續(xù)放置在孵育箱中培養(yǎng)24 h。最后用活性氧試劑盒染色、細(xì)胞核DAPI染色，再用激光共聚焦進(jìn)行拍照。

1.7 CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將胃癌細(xì)胞（AGS及MKN45）鋪板于細(xì)胞培養(yǎng)板貼壁后，在每個(gè)微孔中加入不同濃度的Cu2O納米（0、2、4、16、32以及64 μg/mL）進(jìn)行孵育，并進(jìn)行光照或者非光照處理，繼續(xù)放置在孵育箱中培養(yǎng)24 h；然后，去除培養(yǎng)基、并在每個(gè)待測(cè)微孔中加入100 μL預(yù)先配置好的10%CCK-8試劑；最后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)測(cè)量孔在450 nm處吸光度，并記錄結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，24 h后用CCK-8檢測(cè)試劑盒處理，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度間接判斷細(xì)胞存活率。

1.8 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將胃癌細(xì)胞（AGS及MKN45）鋪板于細(xì)胞培養(yǎng)板貼壁后，利用不同濃度的Cu2O納米（16 μg/mL）進(jìn)行孵育，并進(jìn)行光照或者非光照處理，24 h后去除培養(yǎng)基、胰酶消化重懸并收集細(xì)胞。用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按2×105/100 μL加入至Transwell上室，下室加500 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后取出小室，棉簽拭掉上室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡下選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 20.0處理。計(jì)數(shù)資料比較則采用卡方檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并用Log-rank檢驗(yàn)比較組間差異。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，對(duì)以上結(jié)果均進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Cu2O納米顆粒的形貌

本實(shí)驗(yàn)成功制備Cu2O納米顆粒，透射電鏡圖可見(jiàn)Cu2O納米顆粒是約為100 nm的光滑圓球形（圖1A）。對(duì)Cu2O納米顆粒的水合粒徑及Zeta電位進(jìn)行分析，經(jīng)由馬爾文粒徑儀測(cè)得，Cu2O納米的平均Zeta電位為30±2.4 mⅤ，而其水合平均粒徑為84±14.1 nm（圖1B、C）。

圖1 氧化亞銅(Cu2O)納米顆粒的理化性質(zhì)Fig.1 Physical and chemical properties of Cu2O nanoparticles.A: Morphology of Cu2O nanoparticles under transmission electron microscope(TEM).B:Zeta potential of Cu2O nanoparticles.C:Particle size of Cu2O nanoparticles.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.2 Cu2O納米顆粒的光熱性能

在0.5 W/cm2的近紅外光照條件下，不同濃度的Cu2O納米顆粒展現(xiàn)出不同的光熱性能，濃度越高，光熱效果越強(qiáng)（圖2A）。而對(duì)于不同功率的近紅外光照條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其溫度逐漸升高。其中0.5 W/cm2近紅外光照條件下，5 min后，Cu2O納米系統(tǒng)溫度可升高50 ℃（圖2B）。

圖2 Cu2O 納米顆粒的光熱性能Fig.2 Photothermal properties of Cu2O nanoparticles.A: Photothermal effect of different concentrations of Cu2O nanoparticles.B:Photothermal effect of Cu2O nanoparticles irradiated by near-infrared light with different powers.

2.3 Cu2O納米顆粒的類芬頓效應(yīng)

在同樣過(guò)氧化氫濃度的條件下，不同濃度的Cu2O在37 ℃以及45 ℃條件下，均展示出不同的吸光度，隨著濃度的增加吸光度越低。在λ=664 nm條件下，吸光度最高（圖3A、B）。在同樣過(guò)氧化氫濃度的條件下，相比于37 ℃，45 ℃條件下的Cu2O展示出更低的吸光度，溫度的升高可提高Cu2O的類芬頓能力。

圖3 Cu2O 納米顆粒的類芬頓效應(yīng)Fig.3 Fenton-like effect of Cu2O nanoparticles.A:Concentration of?OH produced by different concentrations of Cu2O nanoparticles at 37 ℃.B: Concentration of ?OH formed by different concentrations of Cu2O nanoparticles at 45 ℃.

2.4 Cu2O納米顆粒產(chǎn)生ROS的能力

為進(jìn)一步評(píng)估Cu2O納米顆粒的活性氧能力，我們將胃癌AGS細(xì)胞系以及MKN45細(xì)胞系經(jīng)近紅外光照射下（0.5 W/cm2，5 min）后培養(yǎng)24 h后評(píng)估其產(chǎn)生ROS的能力。無(wú)論是AGS 細(xì)胞以及MKN45 細(xì)胞，在與Cu2O納米顆粒共孵育后均可產(chǎn)生ROS。而經(jīng)近紅外光照射下（0.5 W/cm2，5 min）后，AGS細(xì)胞何MKN45細(xì)胞產(chǎn)生的ROS量明顯增加（圖4A、B）。

圖4 近紅外光照射下(0.5 W/cm2，5 min)Cu2O 納米顆粒在胃癌AGS細(xì)胞系以及MKN45細(xì)胞系中的活性氧(ROS)生成能力Fig.4 Ability of Cu2O nanoparticles to induce reactive oxygen species (ROS) production in gastric cancer AGS cells and MKN45 cells under 0.5 W/cm2 near-infrared irradiation for 5 min(Original magnification:×100).

2.5 Cu2O納米顆粒抑制胃癌細(xì)胞增殖能力

為進(jìn)一步評(píng)估Cu2O納米的體外抗腫瘤作用，我們用CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估該納米復(fù)合物的細(xì)胞毒性。CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度Cu2O納米顆粒（0、2、4、16、32以及64 μg/mL）處理的AGS及MKN45細(xì)胞存活率均呈濃度依賴性降低，具有顯著抑制增殖作用。此外，在相同濃度Cu2O納米顆粒處理下，經(jīng)近紅外光照（0.5 W/cm2，5 mins）的細(xì)胞存活率更低（圖5A、B）。

圖5 Cu2O 納米顆粒對(duì)胃癌AGS細(xì)胞以及MKN45細(xì)胞活性的影響Fig.5 Effects of Cu2O nanoparticles on viability of gastric cancer AGS cells and MKN45 cells.A: Survival rate of AGS cells treated with different concentrations of Cu2O nanoparticles with or without near-infrared light(0.5 W/cm2,5 min).B:Survival rate of MKN45 cells treated with different concentrations of Cu2O nanoparticles with or without near-infrared light(0.5 W/cm2,5 min).***P＜0.001.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.6 Cu2O納米顆粒抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力

為進(jìn)一步評(píng)估Cu2O納米的體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，我們用Transwell 小室遷移實(shí)驗(yàn)分析AGS 細(xì)胞以及MKN45細(xì)胞遷移潛能水平。相比于空白對(duì)照組，Cu2O納米顆粒處理的胃癌細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)目明顯減少。此外，經(jīng)近紅外光照（0.5 W/cm2，5 min）的細(xì)胞遷移能力更低（圖6）。

圖6 Cu2O 納米顆粒對(duì)胃癌AGS細(xì)胞以及MKN45細(xì)胞遷移能力的影響Fig.6 Effect of Cu2O nanoparticles on migration of gastric cancerAGS cells and MKN45 cells(×100).

3 討論

胃癌在我國(guó)的發(fā)病率僅次于肺癌居第2位，死亡率居第3位，是威脅國(guó)民身心健康的重大疾病［1］。目前，進(jìn)展期胃癌患者治療主要以根治性切除聯(lián)合術(shù)后輔助化療為主的綜合治療［16］。但是傳統(tǒng)的化療藥物（如奧沙利鉑，紫杉醇等）容易引發(fā)脫發(fā)、惡心嘔吐、骨髓抑制等全身多系統(tǒng)毒副作用，還易導(dǎo)致藥物化療耐藥，在一定程度上降低化療藥物的抗腫瘤作用［17-19］。因此在本研究中，我們構(gòu)建了納米載藥平臺(tái)Cu2O，隨后探索了Cu2O納米顆粒的物化表征，包括其形貌、光熱性能以及類芬頓效應(yīng)。結(jié)果表明，與其余銅基納米材料類似，為一光滑圓球形，具有良好的光子特性［20,21］，包括光熱療法，硫族銅化合物在NIR范圍內(nèi)具有化學(xué)計(jì)量依賴的局部表面等離子體激元共振（LSPR）吸收［22］，因此，已得到了廣泛研究，同時(shí)，基于芬頓反應(yīng)的催化納米療法通過(guò)轉(zhuǎn)化過(guò)氧化氫產(chǎn)生有毒的ROS，傳統(tǒng)的鐵基納米試劑芬頓反應(yīng)的pH低（pH=3～4），反應(yīng)速度慢（≈63 M-1s-1），在NIR的作用下銅基納米藥物具有更高的芬頓反應(yīng)速率（≈1×104M-1s-1），反應(yīng)具有更高的pH范圍，所產(chǎn)生的類芬頓效果可產(chǎn)生大量的活性氧用于殺傷腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激過(guò)程［23］。PTT作為一種侵入性較小、且較為有效的抗腫瘤模式，近年來(lái)備受關(guān)注［24］。其中，在癌細(xì)胞上產(chǎn)生強(qiáng)的光照吸收以及高的光熱轉(zhuǎn)換效率是光熱療法能否成功的關(guān)鍵［25］。在納米材料中，銅基納米材料對(duì)光有很強(qiáng)的表面等離子共振吸收效應(yīng)，有很強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換效率，可以在局部范圍內(nèi)迅速加熱，從而在腫瘤的PTT中具有明顯的優(yōu)越性［26-28］。如在4T1細(xì)胞中，QCS/CuSNPs可有效地吸收NIR、產(chǎn)生熱效應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生大量的ROS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［29］。PTT誘導(dǎo)的熱敏化效應(yīng)（如抑制DNA合成和修復(fù)、損傷細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架）可與其他治療模式之間產(chǎn)生協(xié)同作用［30］。

其中，化學(xué)動(dòng)力治療（CDT）的治療模式，是指在腫瘤酸性微環(huán)境下，細(xì)胞中H2O2在金屬催化劑存在的前提下，發(fā)生芬頓或類芬頓反應(yīng)并產(chǎn)生大量的?OH，產(chǎn)生的?OH可通過(guò)氧化還原反應(yīng)損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等從而引起細(xì)胞死亡的一種新型治療模式［31,32］。單一的CDT 作用難以殺滅腫瘤，需輔以其他的治療。而PTT以及CDT均具有腫瘤選擇性、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等特點(diǎn)，在溫度升高的情況下可大大增加化學(xué)動(dòng)力作用，因此，光熱治療聯(lián)合化學(xué)動(dòng)力治療是一種新穎且有效的治療方法［33,34］。文獻(xiàn)報(bào)道一般是將一種具有光熱作用的材料與一種具有化學(xué)動(dòng)力作用的材料相互結(jié)合從而達(dá)到光熱治療聯(lián)合化學(xué)動(dòng)力治療的目［35-37］。選擇合適的光敏劑以及CDT反應(yīng)底物是設(shè)計(jì)、優(yōu)化光熱聯(lián)合化學(xué)動(dòng)力治療的關(guān)鍵。然而，通常來(lái)說(shuō)選擇的PTT 以及CDT反應(yīng)底物為兩種不同的納米材料，涉及到兩種材料的結(jié)合，因此存在著載體與配體是否能夠緊密結(jié)合、相互作用比例和兩者結(jié)合的復(fù)合物是否穩(wěn)定的問(wèn)題。因此，探索一種既具有光熱治療效果亦具有化學(xué)動(dòng)力效果的納米復(fù)合物尤為迫切。近年來(lái)，銅基納米材料在CDT中蓬勃發(fā)展，極大地提高了CDT的效率［38］。銅基納米材料作為無(wú)機(jī)納米材料具有獨(dú)特的電光聲磁性能；同時(shí)在制備過(guò)程中更易控制和調(diào)整其結(jié)構(gòu)、組成、形態(tài)和尺寸，因此在多種腫瘤成像和治療中起到了越來(lái)越大的作用［39］。尤其是Cu+，可與H2O2發(fā)生類芬頓反應(yīng)生成大量的?OH，可用于腫瘤的CDT作用。除此以外，銅基納米材料還具有良好的光熱轉(zhuǎn)換能力，可將吸收的NIR有效轉(zhuǎn)換為熱能。PTT產(chǎn)生的熱能可促進(jìn)銅參與的類芬頓反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)銅介導(dǎo)的CDT作用［40,41］。如，PEGCu2Se在乳腺癌的治療中，可通過(guò)介導(dǎo)PTT與CDT的協(xié)同治療，起到比單一的PTT或CDT更佳的抗腫瘤療效［41］。

在本研究中，我們利用Cu2O的光熱轉(zhuǎn)換性能以及類芬頓效應(yīng)，探討其在胃癌細(xì)胞中的抗腫瘤效應(yīng)。在我們的前期工作里，已對(duì)Cu2O納米顆粒進(jìn)行表征，XPS證明了銅元素的價(jià)態(tài)［42］；在體外實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)了Cu2O可在胃癌細(xì)胞中產(chǎn)生ROS，而在NIR照射條件下可提高局部溫度，繼而在高條件下可產(chǎn)生更多的ROS。這表明，Cu2O可在胃癌細(xì)胞中引起CDT作用。進(jìn)一步的，Cu2O在NIR照射下，較于無(wú)NIR照射條件下，明顯引起了更多胃癌細(xì)胞的死亡以及減少了胃癌細(xì)胞的遷移，這說(shuō)明NIR介導(dǎo)的PTT可增加CDT作用。以上結(jié)果均表明Cu2O納米顆粒在胃癌細(xì)胞中可通過(guò)PTT/CDT協(xié)同作用產(chǎn)生ROS，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，并且與PDT或CDT單一治療方式相比，具有更高的抑瘤效果。這提示著Cu2O納米顆粒利用PTT/CDT協(xié)同作用產(chǎn)生ROS是一類新型的增強(qiáng)胃癌藥物療效的潛在治療策略，后續(xù)研究可進(jìn)一步探討該治療策略的體內(nèi)抗腫瘤作用。然而，本研究仍缺少對(duì)于PTT/CDT協(xié)同作用引起胃癌細(xì)胞死亡過(guò)程中深層機(jī)制的探討，這仍需我們進(jìn)一步探索。

綜上，本研究中，我們制備了Cu2O納米顆粒，其具有良好的光熱轉(zhuǎn)換能力、類芬頓效應(yīng)，并初步驗(yàn)證了Cu2O納米顆?？赏ㄟ^(guò)PTT/CDT協(xié)同作用在胃癌細(xì)胞中產(chǎn)生大量的ROS，從而介導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡以及抗胃癌細(xì)胞遷移。