趙電波，王少丹，王博華，相啟森，鄭凱茜

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002)

微生物污染易導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，不僅會降低食品的營養(yǎng)價值與感官品質(zhì)，而且極易引起急性或慢性食物中毒，危害人體健康[1-2]。因此，食品保鮮一直是食品安全控制中的重要研究內(nèi)容。目前，添加化學(xué)防腐劑是調(diào)味品、果蔬、肉制品等常用的保鮮方法，主要包括山梨酸鈉、亞硝酸鹽類等[3]。研究表明，上述化學(xué)防腐劑的使用不僅會破壞食品本身的營養(yǎng)，而且會對人體健康造成潛在危害[4]。因此，開發(fā)新型、安全、高效的抗菌劑是食品保鮮領(lǐng)域的重要研究方向之一。

月桂酰精氨酸乙酯(lauroyl arginate ethyl， LAE)是一種陽離子型表面活性劑，對多種食源性病原菌有較高的抑制活性。2005年，LAE被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration， FDA)批準(zhǔn)為一般公認(rèn)安全(Generally Recognized as Safe， GRAS)類食品添加劑。2007年，歐洲食品安全局(European Food Safety Authority， EFSA)批準(zhǔn)LAE用于果汁飲料、肉制品、咸魚干、預(yù)制沙拉等食品的保鮮。2011年，LAE被國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission， CAC)列入《食品添加劑通用法典標(biāo)準(zhǔn)》，可用于多種食品及生鮮農(nóng)產(chǎn)品的保鮮[5-6]。本文綜述了LAE的理化特性、抗菌活性以及在果蔬、肉制品、乳制品、水產(chǎn)品和食品包裝等方面的應(yīng)用研究進(jìn)展，并討論了現(xiàn)有研究存在的問題和今后的研究方向，以期為LAE在食品保鮮中的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 月桂酰精氨酸乙酯概述

1.1 LAE理化特性

LAE是一種陽離子表面活性劑，分子式為C20H41ClN4O3，相對分子質(zhì)量為421.02。LAE由月桂酸、L-精氨酸和乙醇合成，其中L-精氨酸的羧基與乙醇形成酯鍵，α-氨基與月桂酸形成肽鍵(見圖1)。LAE為白色吸濕性粉末，熔點為50.5～58.0 ℃；其水溶性較好(在20 ℃條件下溶解度>247 g/kg)，而油水分配系數(shù)較低(Kow<0.01)，易溶解于乙醇、丙二醇、丙三醇等有機溶劑。研究證實，LAE在pH為3～7的范圍內(nèi)具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和較強的抗菌活性[7]。

圖1 LAE的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of LAE

1.2 LAE合成途徑

LAE的化學(xué)合成途徑見圖2。

圖2 LAE的化學(xué)合成途徑Fig.2 Chemical synthesis pathway of LAE

目前，LAE的制備工藝主要分為兩步：第一步，以L-精氨酸鹽酸鹽和乙醇為原料合成精氨酸乙酯鹽酸鹽；第二步，將精氨酸乙酯鹽酸鹽與月桂酰氯在室溫條件下攪拌進(jìn)行酰胺縮合反應(yīng)。鄭昊學(xué)[8]對現(xiàn)有LAE合成方法進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化，提出了一種新的LAE制備方法，主要包括將精氨酸乙酯鹽酸鹽溶于水中，滴加氫氧化鈉溶液中和氯化氫，生成精氨酸乙酯溶液；在精氨酸乙酯溶液中滴加月桂酰氯，通過添加NaOH溶液將反應(yīng)體系的pH值控制在7.1～7.5，溫度控制在10～20 ℃；反應(yīng)結(jié)束后，加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH至3.0～4.0，再加入乙酸乙酯萃取，所得油相經(jīng)洗滌、除溶劑、干燥等處理后得純度較高的LAE。

1.3 LAE代謝途徑及安全性

在機體內(nèi)，LAE極易代謝。Hawkins等[9]讓兩組志愿者分別口服劑量為1.5 mg/kg體重和2.5 mg/kg體重的LAE。結(jié)果表明，LAE口服后2 h血藥濃度達(dá)到峰值，分別為18.2 ng/mL(1.5 mg/kg劑量組)和23.9 ng/mL(2.5 mg/kg劑量組)。在機體內(nèi)，LAE能夠發(fā)生兩種類型的水解反應(yīng)。首先，L-精氨酸α-氨基與月桂酸之間的肽鍵發(fā)生水解，生成月桂酸和L-精氨酸乙酯，后者繼續(xù)水解并生成L-精氨酸和乙醇；此外，酯鍵也能發(fā)生水解，生成乙醇和月桂酰精氨酸，后者繼續(xù)水解并生成月桂酸和L-精氨酸。L-精氨酸進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為鳥氨酸和尿素；另一方面，鳥氨酸經(jīng)三羧酸循環(huán)最終生成CO2。上述代謝產(chǎn)生的尿素和CO2分別經(jīng)尿液和呼氣排除體外[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，LAE對大鼠的口服半數(shù)致死量(median lethal dose， LD50)為2000 mg/kg體重。Ruckman等[11]發(fā)現(xiàn)LAE對SD大鼠和新西蘭大白兔未觀察到有害作用劑量(no-observed-adverse-effect level,NOAEL)分別為2000，300 mg/(kg·d)；每天采用1143，1286 mg/kg體重的LAE飼喂雄性和雌性SD大鼠，實驗持續(xù)13周，均未發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)毒性；口服劑量為2000 mg/(kg·d)的LAE未對SD大鼠造成發(fā)育毒性；細(xì)菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗)、體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗、哺乳動物細(xì)胞突變試驗等均未發(fā)現(xiàn)LAE具有遺傳毒性。綜上所述，由于LAE在機體內(nèi)的代謝分解產(chǎn)物乙醇、月桂酸和L-精氨酸均為日常飲食普遍存在的化合物，因此LAE具有很高的安全性。

2 LAE抗菌活性及機制

2.1 LAE抗菌活性

研究證實，LAE是一種廣譜抗菌劑，對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母和霉菌等都具有較強的抗菌活性，且最低抑制濃度普遍較低。LAE對常見微生物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)見表1。

表1 LAE對不同微生物的最小抑菌濃度Table 1 MIC of LAE against different mircorgnisms

由表1可知，相對于細(xì)菌，LAE對酵母和霉菌的MIC值相對較高，表明其對酵母和霉菌的抑制作用相對較弱。造成上述現(xiàn)象的原因可能是真菌與細(xì)菌的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成存在較大差異。真菌細(xì)胞壁的厚度一般為100～250 nm，而細(xì)菌僅為15～30 nm，且真菌細(xì)胞壁構(gòu)成較為復(fù)雜，含有葡聚糖、幾丁質(zhì)和纖維素等多種組分，而細(xì)菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖構(gòu)成，結(jié)構(gòu)較為簡單。

2.2 LAE抗菌機制

目前LAE抗菌機制尚不明確。但普遍認(rèn)為，LAE的抗菌作用與其破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能等有關(guān)。Coronel-León等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)終濃度為5.33 μg/mL的LAE處理30 min后，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)細(xì)胞膜通透性增強，且用透射電鏡觀察到用8 μg/mL(MIC)的LAE處理3 h后，細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯的皺縮和破裂。此外，Becerril等[17]采用掃描電鏡觀察到LAE處理組與對照組相比細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，對照組細(xì)胞表面光滑，形狀規(guī)則，而經(jīng)濃度為25 μg/mL(MIC)的LAE溶液處理3 min后，E.coli細(xì)胞表面變得粗糙，細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞和褶皺。Xu等[18]報道，經(jīng)終濃度為400 μg/mL的LAE處理24 h后，指狀青霉孢子的DiBAC4(3)熒光強度由對照組的10.12%顯著升高至98.19%，表明細(xì)胞膜發(fā)生去極化；同時，胞內(nèi)核酸和胞內(nèi)蛋白泄露量也顯著上升，表明其細(xì)胞膜完整性被破壞。此外，Yang等[19]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)終濃度為15 μg/mL的LAE處理30 min后，E.coli顯著降低了2 lg CFU/mL；而在反應(yīng)體系中加入谷胱甘肽和抗壞血酸等抗氧化劑后，E.coli數(shù)量與對照組相比并無顯著性差異，表明LAE的抗菌作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激有關(guān)。綜上所述，LAE處理破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA等胞內(nèi)組分泄露，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，這可能是其發(fā)揮抗菌作用的重要機制。

2.3 LAE對生物被膜的清除作用

生物被膜是自然界微生物為適應(yīng)脅迫環(huán)境，通過分泌胞外多糖等物質(zhì)而形成的有利于生存的微生物群體，極易附著在食品及食品接觸材料表面[20]。由于胞外聚合物等的保護作用，生物被膜抗性更強且很難被清除，造成嚴(yán)重的食品安全隱患和危害[21]。研究證實，LAE能夠有效清除食品表面形成的生物被膜。例如，F(xiàn)u等[22]研究了LAE對哈密瓜表面鼠傷寒沙門氏菌(S.entericaserovarTyphimurium)生物被膜的失活作用。結(jié)果表明，與對照組哈密瓜相比，經(jīng)濃度為2 mg/mL的LAE溶液浸泡處理5 min并于22 ℃貯藏2，12，24 h后，處理組樣品表面鼠傷寒沙門氏菌生物被膜分別減少了6.0，3.57，3.72 lg CFU/cm2。同時，F(xiàn)u等[23]將E.coliO157∶H7接種到哈密瓜表面也得到了類似的結(jié)果。作者發(fā)現(xiàn)經(jīng)濃度2 mg/mL LAE溶液浸泡處理5 min并于22 ℃貯藏2，12，24 h后，與對照組樣品相比，LAE處理組哈密瓜表面E.coliO157∶H7生物被膜分別減少了5.31，1.74，1.21 lg CFU/cm2。此外，研究證實，LAE也能有效清除微生物在不銹鋼和橡膠等食品接觸材料表面形成的生物被膜。Sadekuzzaman等發(fā)現(xiàn)經(jīng)濃度為200 mg/L的LAE溶液浸泡處理2 h后，在不銹鋼表面生長的E.coliO157∶H7、L.monocytogenes、S.enteritidis和S.typhimurium生物被膜分別由初始的6.0，7.2，5.4，5.1 lg CFU/cm2降低到檢測限(1 lg CFU/cm2)以下；經(jīng)濃度為200 mg/L的LAE溶液浸泡處理2 h后，在橡膠表面形成的E.coliO157∶H7、L.monocytogenes、S.enteritidis和S.typhimurium生物被膜分別由初始的6.4，7.0，6.0，5.7 lg CFU/cm2降低至2.9，3.3，2.3，2.1 lg CFU/cm2。此外，Kim等[24]認(rèn)為，LAE可能通過螯合作用降低銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)胞內(nèi)鐵離子濃度，進(jìn)而影響鐵離子相關(guān)細(xì)胞信號通路，最終抑制其生物被膜的形成。

3 LAE在食品保鮮中的應(yīng)用

研究證實，LAE能夠殺滅果蔬產(chǎn)品、肉制品、乳制品和水產(chǎn)品等在加工和儲存過程中污染的細(xì)菌、真菌等有害微生物，并有效保持食品的營養(yǎng)及感官品質(zhì),見表2。

表2 LAE在食品殺菌保鮮中的應(yīng)用Table 2 Applications of LAE in food sterilization and preservation

3.1 LAE在果蔬保鮮中的應(yīng)用

果蔬營養(yǎng)物質(zhì)豐富、水分活度高，在采摘、運輸、銷售等過程中易污染微生物[33]。與含氯消毒劑等相比，LAE具有抗菌活性強、無毒性物質(zhì)殘留等優(yōu)點，已用于生菜、萵苣及哈密瓜等的保鮮。如Huang等研究證實，經(jīng)0.1% LAE溶液清洗20 min后，接種于生菜葉片表面的E.coliO157∶H7和L.innocua分別減少了0.8，1.5 lg CFU/cm2；同時，與對照組樣品相比，LAE處理組生菜的色澤、硬度和電解質(zhì)泄漏率均未發(fā)生顯著變化。除用于果蔬清洗外，LAE也能與其他抗菌物質(zhì)復(fù)配進(jìn)行果蔬涂膜保鮮[34]。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)復(fù)配涂膜液(0.1% LAE、0.5%肉桂精油、0.1%乙二胺四乙酸和1%殼聚糖)處理并于21 ℃儲藏1，3，7，10，14 d后，接種于哈密瓜表面的E.coliO157∶H7分別降低了2.2，2.9，1.3，1.4，1.4 lg CFU/cm2；與對照組樣品相比，LAE處理組哈密瓜的色澤、硬度、可溶性固形物和重量損失等均未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。此外，李陽等[35]報道，經(jīng)復(fù)配涂膜液(700 μg/mL LAE、100 μg/mL尼泊金甲酯鈉和10 mg/mL殼聚糖)浸泡處理10 min，晾干，并于25 ℃儲藏15 d后，青椒腐爛指數(shù)顯著降低；且上述涂膜處理能有效降低青椒的抗壞血酸及葉綠素?fù)p失。綜上所述，LAE處理能夠有效降低果蔬表面的微生物數(shù)量并保持果蔬的品質(zhì)。

3.2 LAE在肉制品保鮮中的應(yīng)用

生鮮肉及肉制品在運輸、加工、儲藏和銷售等過程中極易受到微生物污染，造成營養(yǎng)價值的降低和感官品質(zhì)的劣變，甚至?xí)l(fā)食源性疾病[36]。研究證實，LAE可用于生鮮雞肉、牦牛鮮肉腸等的保鮮。Hawkins等[37]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)5% LAE溶液噴淋60 s后，生鮮雞腿肉表面S.typhimurium顯著降低了1.54 lg CFU/g；4 ℃儲藏1，2，3 d后，LAE噴淋組雞腿肉表面S.typhimurium分別降低了1.64，1.69，1.28 lg CFU/g。此外，彭美玲等發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加LAE(終濃度為0.3 g/kg)的牦牛鮮肉腸菌落總數(shù)顯著降低了2 lg CFU/g；此外，添加LAE能顯著降低產(chǎn)品的汁液流失率和蒸煮損失率并抑制揮發(fā)性鹽基氮含量的升高，同時有效保持產(chǎn)品的感官品質(zhì)。

3.3 LAE在乳制品保鮮中的應(yīng)用

大量研究表明，LAE能夠有效降低存在于鮮乳酪、羊奶酪、低脂牛奶及巴氏殺菌乳等乳制品中的微生物數(shù)量[38-39]。例如，Ma等在脂肪含量為2%的低脂牛奶中分別接種了L.monocytogenes、E.coliO157∶H7及Salmonellaenteritidis，初始菌量均為6 lg CFU/mL，并加入終濃度為700 mg/L的LAE，于21 ℃培養(yǎng)4，8，24，48 h后，與對照組相比，L.monocytogenes分別降低了1.5，2.9，4.4，5.7 lg CFU/mL，E.coliO157∶H7分別降低了1.7，3.2，2.4，0.9 lg CFU/mL，Salmonellaenteritidis分別降低了0.1，1.3，2.7，1.7 lg CFU/mL。除單獨應(yīng)用于乳制品外，LAE也可與其他抗菌劑聯(lián)合使用。Martínez-Ramos等研究了LAE與ε-聚賴氨酸(ε-polylysine，EPL)復(fù)配對鮮乳酪的抗菌作用，在鮮乳酪中接種L.monocytogenes，初始菌量約為4 lg CFU/g，并添加200 μg/g LAE和250 μg/g EPL，真空包裝并在4 ℃儲藏7，14，28 d，與對照組相比，LAE單獨處理組L.monocytogenes分別降低了0，0.2，1.3 lg CFU/g，EPL單獨處理組分別降低了0，2.6，2.3 lg CFU/g，LAE與EPL復(fù)配組分別降低了1.3，2.8，3.6 lg CFU/g。由此可見，在乳制品中添加LAE能夠有效抑制微生物生長，延長貨架期。

3.4 LAE在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用

LAE不僅可以延長果蔬、肉制品、乳制品的保質(zhì)期，也可以應(yīng)用于水產(chǎn)品的保鮮。水產(chǎn)品極易在微生物和酶的作用下，發(fā)生蛋白質(zhì)降解和氧化酸敗，導(dǎo)致生物胺含量超標(biāo)，給產(chǎn)品品質(zhì)帶來不良影響[40]。Demircan等[41]報道，經(jīng)0.1% LAE和2%殼聚糖溶液浸泡2 min后并于2 ℃儲藏0，3，6，9 d，與對照組相比，處理組鯖魚片菌落總數(shù)分別降低了1.05，0.82，2.20，1.21 lg CFU/g，生物胺含量分別降低了6.82，14.37，19.25，21.71 mg/kg。以上結(jié)果表明，LAE能夠降低水產(chǎn)品中的微生物數(shù)量和生物胺含量，延緩其腐敗變質(zhì)。

3.5 LAE在食品抗菌包裝中的應(yīng)用

LAE也被廣泛應(yīng)用于食品抗菌包裝。Demircan等[42]發(fā)現(xiàn)，在殼聚糖薄膜中添加0.1% LAE顯著提高了保鮮膜對紫外、可見光阻隔能力和抗氧化性能。此外，Otero等[43]在聚丙烯和聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜表面添加LAE涂層(4%、6%、8%)，顯著提升了兩種薄膜的抗菌性能。國內(nèi)外學(xué)者還以親水和疏水聚合物為材料，采用靜電紡絲法制備了包封質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的LAE核殼結(jié)構(gòu)的抗菌食品包裝體系，該技術(shù)能夠有效降低食品表面微生物數(shù)量，為提高食品保鮮包裝效果提供了新的思路[44]。

4 結(jié)語

作為一種陽離子表面活性劑，LAE具有廣譜抑菌、安全、無殘留等諸多優(yōu)點，在果蔬、肉制品、乳制品、調(diào)味品等保鮮領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。在今后的工作中首先應(yīng)采用轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等研究方法系統(tǒng)揭示LAE失活微生物的分子生物學(xué)機制?，F(xiàn)有研究證實，食品組分會降低LAE對微生物的殺滅效果，因此，還應(yīng)系統(tǒng)闡明LAE與蛋白質(zhì)、多糖等典型食品組分的相互作用規(guī)律。最后，應(yīng)進(jìn)一步擴大LAE的應(yīng)用范圍，從而不斷推動LAE在食品工業(yè)中的應(yīng)用。