衣程遠(yuǎn)，孫冰玉，劉琳琳，高遠(yuǎn)，廉文濤，朱穎，朱秀清

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省谷物食品與綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

大豆蛋白提供相對(duì)平衡的氨基酸，由于其極高的生物安全性、優(yōu)異的加工能力和低成本等優(yōu)點(diǎn)，常以大豆蛋白為原料制作調(diào)味料和風(fēng)味肽食品[1]。大豆蛋白結(jié)構(gòu)緊密，分子柔性較低，與酪蛋白和乳清蛋白等乳蛋白相比，某些功能性質(zhì)并不理想[2]。在現(xiàn)代食品加工過(guò)程中，對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)要求極高[3]，因此，包括物理、化學(xué)和生物修飾在內(nèi)的許多技術(shù)已被用于改善大豆蛋白的功能性質(zhì)來(lái)滿足生產(chǎn)的需要。以改性蛋白在食品中充當(dāng)乳化劑或乳化穩(wěn)定劑，可充當(dāng)脂溶性活性物質(zhì)的載體，防止油氧化，抑制精油蒸發(fā)等[4]，更好地服務(wù)于食品行業(yè)[5]。

近年來(lái)，超聲波技術(shù)的廣泛應(yīng)用開拓了食品研究的新領(lǐng)域，涵蓋了食品研究開發(fā)中各個(gè)方面，如肉及肉制品加工、超聲滅菌及保鮮、超聲降解、超聲結(jié)晶、超聲波干燥、超聲提取、超聲波催熟陳化酒、超聲波破乳與分離等。超聲波改性技術(shù)是一種物理改性技術(shù)，由于其效果顯著、無(wú)毒無(wú)害、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)保留完整等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[6]。研究表明，超聲波技術(shù)能夠使蛋白質(zhì)的非共價(jià)作用遭到破壞,肽鍵斷裂,分子量發(fā)生變化，引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和聚集方式的改變[7]，蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)也因此改變。超聲改性也可作為其他改性方式的預(yù)處理手段，超聲波能夠打開大豆蛋白致密的三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)，從而更容易受到其他改性方式的影響，達(dá)到更好的改性效果。

本文闡述了超聲波的作用機(jī)制及其對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)和功能性的影響，介紹了超聲復(fù)合改性的應(yīng)用，為研究大豆蛋白在超聲改性過(guò)程中結(jié)構(gòu)變化機(jī)制提供了理論支撐。

1 超聲波概述

超聲波是頻率高于人類聽覺(jué)閾值(20 kHz)的機(jī)械波，它在液體中傳播時(shí)會(huì)產(chǎn)生交替變換的正負(fù)壓力，當(dāng)形成的壓力超過(guò)液體分子間的吸引力時(shí)，液體中的氣體被抽離出液體形成空穴氣泡[8]。超聲波在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的局部壓差使空穴氣泡快速壓縮和伸展最終破碎。在空穴氣泡破碎的瞬間，空穴周圍的液體沖進(jìn)空穴，產(chǎn)生強(qiáng)烈的局部震蕩，產(chǎn)生空化效應(yīng)。氣泡的破碎會(huì)產(chǎn)生湍流、微束流等機(jī)械效應(yīng)，部分聲能可以作為熱量被介質(zhì)吸收。此外，超聲過(guò)程中部分水分子分解成高活性自由基：H2O2→H+·OH[9]，生成的活性自由基可對(duì)糖汁脫色起到一定的強(qiáng)化作用[10]，也可進(jìn)一步反應(yīng)生成H2O2，從而氧化游離巰基并導(dǎo)致亞磺酸和磺酸的形成。超聲波的空化效應(yīng)及其他效應(yīng)見(jiàn)圖1。

2 大豆蛋白的組成與結(jié)構(gòu)

大豆蛋白根據(jù)離心系數(shù)可分成4個(gè)組分——2S、7S、11S、15S，其中90%的蛋白以儲(chǔ)藏蛋白7S和11S的形式存在[12]。7S是由α、α′和β 3個(gè)亞基以疏水作用維持的三聚體。由于缺少半胱氨酸，α、β亞基間沒(méi)有二硫鍵存在。α和α′亞基的疏水性和等電點(diǎn)均低于β亞基[13]。11S是由6個(gè)亞基組成的疏水性六聚體，11S的亞基之間通過(guò)二硫鍵將帶羧基的酸性多肽和帶醇基的堿性多肽連接，其中堿性多肽表面有大量的疏水基團(tuán)。6個(gè)由酸堿多肽組成的亞基堆疊在一起形成了環(huán)狀分布的11S球蛋白六聚體[14]。

超聲作用對(duì)大豆蛋白的不同組分影響不同，Zhao等[15]指出7S比11S更容易變性。7S球蛋白由3個(gè)亞基通過(guò)非共價(jià)鍵構(gòu)成，易受環(huán)境影響而聚集和解離。11S球蛋白由酸性、堿性多肽構(gòu)成兩個(gè)環(huán)狀六角形結(jié)構(gòu)，酸性和堿性多肽交互排列使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。11S球蛋白分子呈扁橢圓形狀，具有一定的剛性，因此超聲作用對(duì)其影響較弱。

3 超聲波對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響

超聲處理不改變蛋白的氨基酸序列，因而不改變其一級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與其特有的氫鍵形式密切相關(guān)。超聲過(guò)程中產(chǎn)生的空化效應(yīng)、湍流效應(yīng)等作用力使維持α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角的氫鍵斷裂，各殘基間有了更大的空間，大豆蛋白分子去折疊化，變得相對(duì)線性化，分子柔性得到極大增強(qiáng)。Tang等[16]指出超聲破壞了由疏水相互作用、氫鍵維持的蛋白聚集體。超聲處理后大豆蛋白中β-折疊含量減少，無(wú)規(guī)則卷曲含量升高。無(wú)規(guī)則卷曲與疏水性呈正相關(guān)[17]。β結(jié)構(gòu)是維持聚集體的重要成分，其含量代表著蛋白質(zhì)分子間的疏水作用力，即超聲破壞了由疏水作用維持的蛋白聚集體，增大了蛋白分子的疏水性。Jambrak等[18]發(fā)現(xiàn)超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)能夠使蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的二硫鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致游離巰基增多，分子柔性增加。綜上所述，超聲處理減弱了大豆蛋白中各個(gè)殘基間的相互作用力，使原本緊密的結(jié)構(gòu)打開，分子更加舒展，但同時(shí)也會(huì)使大豆蛋白中的無(wú)序結(jié)構(gòu)增多。

4 超聲波對(duì)大豆蛋白功能性的影響

4.1 超聲波對(duì)大豆蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質(zhì)變性和聚集的量度，它可以影響其他功能特性，甚至是其他性質(zhì)的前提。

Zhou等[19]發(fā)現(xiàn)超聲處理改善了大豆蛋白的溶解度。超聲波的空化效應(yīng)會(huì)使氣泡周圍區(qū)域的溫度和壓力增加，導(dǎo)致大豆蛋白中小聚集體破裂，蛋白質(zhì)分子顆粒尺寸減小，增大了蛋白分子與液體接觸的表面積，從而增加了蛋白質(zhì)-水的相互作用。此外，Tang等發(fā)現(xiàn)超聲促使大豆蛋白中的堿性亞基從不溶性沉淀物轉(zhuǎn)化為可溶性聚集體。11S的堿性亞基有大量疏水基團(tuán)，易自聚集形成不溶性沉淀，而7S則發(fā)生可溶性聚集。經(jīng)過(guò)超聲處理后，不溶性沉淀物疏水基團(tuán)暴露，其堿性亞基與7S的β亞基和其他亞基通過(guò)疏水作用結(jié)合，部分通過(guò)二硫鍵與α′亞基結(jié)合，堿性多肽通過(guò)靜電相互作用與β-伴球蛋白的亞基形成了可溶性復(fù)合物，抑制了蛋白分子的聚集沉淀[20]。7S亞基與不溶性聚集體的結(jié)合為11S帶來(lái)了大量親水基團(tuán)，從而轉(zhuǎn)變成可溶性聚集體。隨著聚集過(guò)程的進(jìn)行，當(dāng)聚集尺寸超過(guò)溶劑的可溶解范圍時(shí)，再次誘導(dǎo)了沉淀的生成，降低了溶解度。可溶性聚集體的形成過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖2 超聲處理促使不溶性聚集體向可溶性聚集體轉(zhuǎn)變的過(guò)程Fig.2 The process of transformation from insoluble aggregates to soluble aggregates by ultrasonic treatment

綜上所述，超聲處理增大了蛋白分子與水的相互作用，并抑制了11S自聚集成不溶性聚集體，提高了大豆蛋白的溶解性。

4.2 超聲波對(duì)大豆蛋白界面性質(zhì)的影響

大豆蛋白的界面性質(zhì)主要包括乳化作用和起泡特性。蛋白質(zhì)的吸附動(dòng)力學(xué)受分子尺寸和結(jié)構(gòu)的影響，分子尺寸越小、柔性越大，越容易在界面上分散和重排。未經(jīng)超聲處理的蛋白分子由于其折疊的結(jié)構(gòu)以及較少的疏水基團(tuán)，與油滴結(jié)合不充分形成凹凸起伏的界面膜；超聲后的大豆蛋白具有較高的蛋白吸附組分和較低的飽和表面負(fù)荷，其溶解性、表面疏水性及分子柔性均有所增加[21]，在油水界面快速擴(kuò)散，充分與油滴結(jié)合形成剛性穩(wěn)定致密的膜，界面性質(zhì)得到提高。超聲對(duì)大豆蛋白界面性質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲對(duì)大豆蛋白界面性質(zhì)的影響Fig.3 Effect of ultrasound on interface properties of soybean protein

朱秀清等[22]指出表面疏水性的增加有利于蛋白分子形成穩(wěn)定和剛性的膜，在油滴界面具有更好的吸附能力；柔性好的蛋白可確保其多肽鏈骨架的舒展，乳化性和起泡性高。過(guò)度的超聲處理會(huì)使蛋白分子形成共價(jià)或非共價(jià)聚合物[23]，吸附速率減慢，從而使大豆蛋白界面性質(zhì)降低。

綜上所述，超聲波使蛋白分子展開，柔性及疏水性增加，從而提高了大豆蛋白的界面性質(zhì)，但過(guò)度的超聲處理也會(huì)導(dǎo)致蛋白分子的再次聚集而降低其界面性質(zhì)。因此，在實(shí)際應(yīng)用中要選擇適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚項(xiàng)l件，控制好蛋白分子的分散與聚集，以獲得所需要的功能特性。

4.3 超聲波對(duì)大豆蛋白凝膠特性的影響

凝膠特性與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用有關(guān)。Tang等[24]發(fā)現(xiàn)超聲處理后的大豆蛋白疏水性殘基與游離巰基增多，促進(jìn)了凝膠過(guò)程中二硫鍵的形成，形成的凝膠更加穩(wěn)定、均一。在超聲過(guò)程中，由于空化效應(yīng)和湍流效應(yīng)等產(chǎn)生的機(jī)械力使大豆分離蛋白聚集體減少，更好地分散在溶液中，促進(jìn)了分子間的相互作用[25]。β-折疊水合程度比α-螺旋更高，常存在于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，超聲后隨著大豆蛋白結(jié)構(gòu)的展開而暴露，平行或反平行排列的β折疊片之間的分子氫鍵可作為凝膠網(wǎng)絡(luò)的連接區(qū)。此外，超聲處理后球狀蛋白質(zhì)的有效疏水性增加，游離巰基暴露于大豆分離蛋白分子的表面，在形成凝膠的過(guò)程中因超聲作用暴露的游離巰基轉(zhuǎn)化成二硫鍵，并且增加了氫鍵等非共價(jià)鍵的形成，而二硫鍵和氫鍵的形成促進(jìn)了大豆蛋白的線性聚集[26]。超聲處理對(duì)大豆蛋白凝膠性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲對(duì)大豆蛋白凝膠性的影響Fig.4 Effect of ultrasound on gelation of soybean protein

綜上所述，超聲處理可引起大豆分離蛋白的解離與部分展開，表現(xiàn)為粒徑的減小，疏水性、游離巰基含量的增加，促進(jìn)了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用，在凝膠過(guò)程中會(huì)形成更多的疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等作用力，提高了蛋白質(zhì)的凝膠性。

5 超聲復(fù)合改性的應(yīng)用

大豆蛋白作為重要功能性成分被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，為了滿足消費(fèi)者日益增長(zhǎng)的物質(zhì)要求，大豆蛋白的改性加工手段尤為重要。然而單一的改性方式存在諸多不足，所以復(fù)合改性技術(shù)成為以后蛋白質(zhì)改性的主要發(fā)展趨勢(shì)。

糖基化反應(yīng)是指還原糖的羰基共價(jià)附著在蛋白質(zhì)的游離氨基上。糖基化程度取決于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，當(dāng)二硫鍵被破壞，球蛋白的緊密結(jié)構(gòu)被打開時(shí)，糖基化反應(yīng)明顯增強(qiáng)。Mu等[27]證明超聲處理可促進(jìn)大豆蛋白與阿拉伯膠的嫁接反應(yīng)，提高改性效率。李素云等[28]發(fā)現(xiàn)超聲輔助糖基化反應(yīng)比傳統(tǒng)濕熱法得到更高濃度的調(diào)味化合物。超聲預(yù)處理通過(guò)改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，增加了糖基化位點(diǎn)，提高了糖基化程度[29]。糖分子可以增加蛋白質(zhì)分子之間的間距，削弱分子間的疏水作用，抑制聚集，提高了蛋白的功能特性。與糖基化改性相類似，大豆蛋白緊密的三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)使其抵抗酶解，超聲波的空化作用破壞了這種緊密的結(jié)構(gòu)，暴露更多的酶解位點(diǎn)，提高了蛋白質(zhì)的水解度。Chen等[30]指出超聲處理能夠明顯促使大豆蛋白中的亞基被木瓜蛋白酶水解。因此，通過(guò)超聲預(yù)處理復(fù)合改性，可以縮短反應(yīng)時(shí)間，改性效果更好，是一種高效的蛋白質(zhì)修飾方法。

6 展望

超聲作為一種綠色溫和的預(yù)處理方式已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如簡(jiǎn)化調(diào)味化合物的提取步驟并增加其功能性、提高蛋白乳化性、促進(jìn)湯汁脫色等。超聲波技術(shù)可改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改變蛋白質(zhì)的功能特性，進(jìn)一步提高大豆蛋白的功能性質(zhì)。為了使超聲技術(shù)更好地服務(wù)于食品領(lǐng)域，需要進(jìn)一步增強(qiáng)超聲改性的可控性，了解超聲參數(shù)(時(shí)間、強(qiáng)度和頻率)對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的影響程度；在生產(chǎn)中注意超聲的氧化效應(yīng)，使其在改性中產(chǎn)生良性影響；規(guī)?；?、連續(xù)化的超聲改性模式還需在生產(chǎn)中完善。隨著對(duì)超聲機(jī)制的進(jìn)一步探索，相信超聲改性也將更大地提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。