TIN Hoe-seng

(華南師范大學 化學與環(huán)境學院，廣州 510631)

牡蠣又名蠔、蠣黃、海蠣子，屬軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、異柱目(Anisomyaria)、牡蠣科(Ostreinae)，是世界上重大的養(yǎng)殖貝類，同時也是我國養(yǎng)殖產量很大的經濟貝類，尤其在廣東、廣西、福建、浙江、臺灣等沿海地區(qū)資源非常豐富[1]?！?020中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》數(shù)據(jù)顯示[2]，2019年中國牡蠣海水養(yǎng)殖產量達到522.56萬噸，相比2018年的513.98萬噸增長1.7%。中國牡蠣的主要產地集中在福建和廣東等地，福建牡蠣養(yǎng)殖歷史悠久，迄今已成為中國較大的牡蠣養(yǎng)殖區(qū)。2019年福建省牡蠣海水養(yǎng)殖產量達到201萬噸，位居全國前列，其次是廣東省114萬噸。牡蠣不僅含有豐富的營養(yǎng)物質，如蛋白質(包括8種人體必需氨基酸)、糖原、維生素及鋅、硒、鐵、銅、碘等微量元素，而且具有增強機體免疫力等多種保健功能[3-4]。此外，牡蠣肉細嫩、味鮮美，具有良好的食品加工價值，其中蠔油是牡蠣精深加工的主要產品之一。

蠔油是一種利用牡蠣蒸煮后的汁液(即蠔汁)進行濃縮或直接酶解牡蠣肉，再加入糖、食鹽、淀粉或改性淀粉等原料，輔以其他配料和食品添加劑制成的調味品[5]。其成品鮮亮有光澤、蠔香濃郁、滋味鮮美、入口滑潤、營養(yǎng)價值高，深受廣東、福建、港澳臺及東南亞地區(qū)消費者的喜愛，在內陸地區(qū)的市場銷售份額也逐漸擴大[6-7]。

蠔油等水產調味品的滋味主要包括鮮、甜、咸、苦、酸等。其中鮮味也是水產品的特征風味之一，主要的鮮味物質有鮮味氨基酸(如谷氨酸)[8]、呈味核苷酸(如IMP和GMP等)、呈味肽、乳酸、琥珀酸等[9-10]。還有許多協(xié)同增鮮物，如丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸及一些無機物等。呈味肽一般是指對食品風味有一定貢獻的寡肽類物質，是從食物中提取或由氨基酸合成，包括特征滋味肽和風味前體肽[11]。呈味肽具有多種滋味特征，其呈味效果往往不是單一的某種滋味，而是各種滋味的綜合效應，從而賦予食品鮮美濃郁、圓潤香滑、回味悠長的味感，能夠通過協(xié)同作用呈現(xiàn)出一定的鮮味特征[12]，為食品增添風味，同時還能提供肽及氨基酸類營養(yǎng)成分[13]，是蠔油極為關鍵的風味物質。

許凌志[14]利用模糊技術評價發(fā)酵蠔油，但該研究只納入了脂肪、蛋白質及氨基酸總量為關鍵指標組分，不足以精準衡量其中的關鍵物質。王豐[15]針對不同加工工藝對濃縮蠔汁風味的影響進行研究，并利用氨基酸分布及感官鑒評對不同加工工藝的蠔汁進行評價，并未對除了氨基酸之外的組分進行研究。然而，目前針對牡蠣或蠔油中非揮發(fā)性風味物質的研究較少，尤其是蠔油呈味肽信息更是稀缺[16-17]。

本研究選擇不同品牌的蠔油，研究非揮發(fā)性風味物質含量的差異性，采用溶劑溶解-離心分離的方法進行前處理，樣品上清液經濾膜過濾后直接使用液相色譜-四極桿飛行時間質譜儀進行分析，在較寬的質量范圍內，對蠔油中的非揮發(fā)性物質實現(xiàn)分離和鑒別；通過數(shù)理統(tǒng)計軟件篩選可能的備選物，再通過二級質譜的目標物碎片掃描，結合譜庫檢索，推測出目標物的結構。該研究結果以期能夠為蠔油產品風味質量的精準控制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蠔油：購于線下超市以及線上電商；色譜純甲醇、色譜純乙腈、分析純甲酸：美國賽默飛世爾公司。

Agilent 6545B LC/Q-TOF MS四極桿飛行時間液質聯(lián)用系統(tǒng)、離子源類型ESI； Eppendorf 5804R低溫高速冷凍離心機；Milli-Q Synergy Water Purification System超純水機。

1.2 方法

稱取5.0 g蠔油待測樣品于離心管中，然后向離心管中加入5.0 mL甲醇(色譜純)溶液，采用渦旋混合器充分混合均勻，靜置10 min后，以10000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm的有機相濾膜，最后將上清液直接進行進樣分析。

液相色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)。

流動相：含0.1%甲酸的高純水(溶劑A)、乙腈(溶劑B)。流速為0.30 mL/min，進樣體積為5.0 μL，洗脫方式見表1。

表1 流動相洗脫方式Table 1 Mobile phase elution method

柱溫箱溫度30 ℃，自動進樣器溫度25 ℃，正離子模式掃描。干燥氣溫度為325 ℃，干燥氣流速為10 L/min，鞘氣(N2)溫度為350 ℃，鞘氣流速為11 L/min，霧化氣壓力為10 psi，毛細管電壓為4000 V。采樣模式全掃描，質荷比范圍50～1500 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用MassHunter Profinder軟件處理LC/MS一級質譜數(shù)據(jù)：通常使用批量遞歸特征提取的方式提取化合物，選擇Batch Recursive Feature Extraction (small molecules/peptides)，依次設定保留時間、質量數(shù)范圍(250～1000 Da)、基線特征、加和離子類型和模式、同位素類型、化合物電荷數(shù)量等諸多參數(shù)，運行批處理后，得到提取出的化合物列表(未對化合物進行結構鑒定)，且包含化合物對應的色譜圖和質譜圖。最后將生成的化合物列表導出為cef文件，供MPP軟件進一步分析。

使用Mass Profiler Professional軟件進行數(shù)據(jù)分析：將ProFinder軟件導出的cef數(shù)據(jù)文件導入MPP軟件，對數(shù)據(jù)進行篩選、排序，完成數(shù)據(jù)分組和過濾，對化合物響應值進行歸一化處理，選擇合適的響應基線，完成數(shù)據(jù)導入。之后軟件將自動創(chuàng)建一個顯著性分析的工作流程，用于創(chuàng)建在組間有顯著性差異的化合物。按顯著性分析的步驟流程，能夠在不同來源、品牌的蠔油的眾多揮發(fā)性化合物中，找出在組間響應值有顯著性變化的化合物，并導出差異化合物列表。

二級質譜掃描：一級質譜掃描得到的共有的特征化合物并未進行譜庫檢索定性，需要進一步進行二級質譜掃描。針對在蠔汁/蠔油中存在組間顯著性差異的共有化合物，將其保留時間、母離子質荷比、碰撞能量等參數(shù)導入液質Targeted MS/MS掃描方法中，對樣品進行二級質譜數(shù)據(jù)的采集，采集的結果與代謝庫和多肽庫等相關數(shù)據(jù)庫進行比對，對這些共有化合物進行定性。

2 結果與分析

將4種蠔油中的非揮發(fā)性化合物數(shù)據(jù)導入MPP軟件，經顯著性分析，4種蠔油中的共有特征化合物共計67種，占總數(shù)的23.1%，具體見圖1。

圖1 4種蠔油共有的特征化合物Fig.1 Common characteristic compounds in the four kinds of oyster sauce

對于通過一級質譜篩選出的特征化合物，采用UHPLC再次對樣品進行分離，電噴霧解離后，在碰撞室內被轟擊后，斷裂成碎片離子，根據(jù)碎片離子質荷比的不同進一步分離，被檢測器接收，最終形成MS/MS圖譜。多肽斷裂過程中，主要形成衛(wèi)星離子、序列離子和中間碎片離子，其中a，b和c為多肽N末端離子，x，y和z為多肽C端離子，而同一系列內相鄰的離子碎片之間質荷比的差值可以體現(xiàn)它們之間相差的氨基酸信息。由于多肽鏈中的酰胺鍵更易于斷裂，使得b和y離子在二級質譜中出現(xiàn)的幾率較大，因此可將二級質譜中的b和y離子碎片解出多肽鏈的氨基酸序列。

選擇共有化合物中響應值較高的若干化合物，對其二級質譜進行解析，見圖2。由圖2可知，保留時間在17.4 min左右的化合物被鑒定為Glu-Cys。其基峰離子為加和物[M+NH4]+=268.097 Da，其分子離子峰M+=250.087 Da。其碎片離子中強度最高的為130.065 Da，推測是Glu殘基；二者之差為120.097 Da，推測為Cys殘基。

依照上述類似的解析方法，對較高響應值的共有化合物進行二級質譜的解析，見圖3。由圖3可知，保留時間在1.85 min左右的化合物被鑒定推測為Thr-Phe-Lys-Leu；保留時間在5.47 min左右的化合物被鑒定推測為Gly-Pro-Pro-Val；保留時間在14.57 min左右的化合物被鑒定推測為Arg-Ser-Thr-Thr；保留時間在32.19 min左右的化合物被鑒定推測為Cys-Trp-Ser。

圖2 UHPLC-ESI-Q-TOF MS/MS鑒定蠔油中多肽的氨基酸序列(1)Fig.2 Amino acid sequence of the polypeptides in oyster sauce determined by UHPLC-ESI-Q-TOF MS/MS (1)

(a) Thr-Phe-Lys-Leu

(b) Gly-Pro-Pro-Val

(c) Arg- Ser-Thr-Thr

(d) Cys-Trp-Ser

4種蠔油中的非揮發(fā)性化合物數(shù)據(jù)經解析鑒定后，得到26種多肽類化合物(見表2)，其摩爾分子質量介于250～670 Da之間，具有2～5個碳原子的支鏈，在4種蠔油中相對含量有所差異。其中，Asp-Leu-Arg(Cpd11)，Thr-Phe-Lys-Leu(Cpd04)及Asp-Glu-Ile-Leu (Cpd42) 在蠔油1中的相對豐度達到了16.81%、10.78%、10.59%。在蠔油2中發(fā)現(xiàn)，Ile-Glu-Asp-Phe(Cpd41)及 Ser-Ile-Asn-Val(Cpd10)的相對豐度分別達到了19.64%及18.56%。寡肽Ile-Glu-Asp-Phe(Cpd41)及Asp-Glu-Ile-Leu (Cpd42)在蠔油3中也達到了19.99%及17.25%的水平。蠔油4中Thr-Phe-Lys-Leu(Cpd04)及Val-Pro-Gln-Val(Cpd32)分別達到了15.80%及13.04%的水平。這些寡肽主要來自于酶作用下的蛋白質酶解以及蒸煮過程中水解所形成的寡肽[18]。

將所有多肽數(shù)據(jù)導入MPP軟件，經顯著性分析，4種蠔油可以聚為兩類，蠔油1、蠔油2和蠔油3明顯較為接近，而蠔油4與前三者存在一定的差異(見圖4)，進一步說明4種蠔油在加工工藝上有一定的差異。王豐討論了4種加工工藝(原汁蠔油加工、復合蠔汁加工、酶法釀造蠔汁加工和復合蠔汁加工工藝改進)對濃縮蠔汁風味的影響，并得出不同加工工藝對蠔汁品質的影響相當顯著，與本文得到的聚類結果相符。

研究表明，肽鏈長度在一定程度上影響著肽分子的呈味性能。呈味肽氨基酸骨架結構式氨基酸數(shù)量在3～9 u之間，取值在4～6 u之間鮮味最強[19]。在鮮味肽的呈味規(guī)律機理研究中發(fā)現(xiàn)，不論是來自于谷元粉[20]、大豆[21]或者豆醬[22]，其分子量均集中在100～5000 u之間，集中在<1000 u范圍內，與本研究中所鑒定的肽分子質量一致。此外，鮮味肽的氨基酸組成直接影響著其呈味效果。據(jù)報道，鮮味肽序列中通常含有Glu和Asn酸性基團的1種或2種[23]，或是含有一定的親水性氨基酸殘基Tyr、Gly、Thr、Phe、Asp等[24]，且在堿性氨基酸和酸性氨基酸共同存在的情況下鮮味肽方可呈現(xiàn)出鮮味,與本文相符。

表2 4種蠔油中多肽特征化合物相對豐度Table 2 Relative abundance of polypeptide characteristic compounds in the four kinds of oyster sauce

續(xù) 表

圖4 4種蠔油中多肽特征化合物聚類樹狀圖Fig.4 Dendogram of polypeptide characteristic compounds in four kinds of oyster sauce

3 結論

應用MassHunter Profinder軟件處理LC/MS一級質譜數(shù)據(jù)，并結合Mass Profiler Professional軟件進行顯著性分析，在不同的蠔汁和蠔油中成功找出組間響應值有顯著性變化的化合物。利用二級質譜掃描，結果與代謝庫和多肽庫等相關數(shù)據(jù)庫進行比對，對這些化合物進行定性分析，蠔油中的非揮發(fā)性化合物數(shù)據(jù)經解析鑒定后得到26種多肽類化合物。結果表明，研究建立的方法體系將多肽數(shù)據(jù)經顯著性差異分析能夠將蠔油進行聚類，明確蠔油中特征物質的差異性，可為蠔油風味質量控制研究提供一定的參考。