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        釀酒酵母發(fā)酵制備蒜氨酸的工藝研究

        2022-12-05 12:39:18戴慧敏王立三涂媛蔡俊
        中國調(diào)味品 2022年12期
        關(guān)鍵詞:烯丙基硫醇氨酸

        戴慧敏,王立三,涂媛,蔡俊*

        (1.湖北工業(yè)大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 工業(yè)微生物湖北省重點實驗室 發(fā)酵工程教育部重點實驗室,武漢 430068;2.勸農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)公司,湖北 恩施 444324)

        蒜氨酸,化學(xué)名為S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜,是一種存在于百合科蔥屬植物鱗莖中的較穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)類含硫氨基酸。高純度的蒜氨酸是無臭無味的白色晶體,易溶于水但不溶于乙醇[1-3]。現(xiàn)代科學(xué)表明,蒜氨酸有降低膽固醇、預(yù)防肥胖、抗腫瘤和抗癌等功能[4-8],與肌苷酸或葡萄糖反應(yīng)后的分離物具有烤肉味和蒜香味[9],可以被廣泛應(yīng)用于調(diào)味品的生產(chǎn)。此外,蒜氨酸對多種微生物尤其是食品腐敗菌的生長有極強的抑制作用,并且對人體無毒害[10-13],是國內(nèi)外均認(rèn)可的食品添加劑[14]。因此,蒜氨酸既可作為良好的食品防腐劑來延長果蔬的保鮮期[15-16],也可以被開發(fā)成一種高效的藥物制劑,具有很好的應(yīng)用前景。

        目前蒜氨酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法[17-19]、組織培養(yǎng)法[20-21]和從植物中提取?;瘜W(xué)合成法得率高,但是由于原料中的烯丙基溴具有強毒性,對人體和環(huán)境會造成較大的危害,反應(yīng)收率低,后處理麻煩,并且化學(xué)合成會產(chǎn)生兩種立體異構(gòu)體L-(+)蒜氨酸和L-(-)蒜氨酸,而天然蒜氨酸僅以L-(+)形式存在,因此限制了它的應(yīng)用范圍。從植物中提取包括水提醇沉法和有機溶劑提取法,水提醇沉法的工藝不夠成熟,而有機溶劑存在潛在的毒性,并且蒜酶的存在會導(dǎo)致蒜氨酸的分解,給蒜氨酸的提取造成了一定的難度,進(jìn)一步增加了成本[22-24],因此開發(fā)綠色安全的生物法生產(chǎn)蒜氨酸勢在必行。

        植物體內(nèi)的蒜氨酸是在半胱氨酸合成酶的作用下,由絲氨酸與乙酰輔酶A結(jié)合生成 O-乙酰絲氨酸后,與烯丙基硫醇結(jié)合生成 S-烯丙基-L-半胱氨酸,再氧化 S-烯丙基-L-半胱氨酸形成[25]。在微生物體內(nèi),絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)和O-乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶(OASS)共同組成酶復(fù)合體,即半胱氨酸合成酶。微生物也能利用半胱氨酸合成酶將環(huán)境中的無機硫還原成S2-,進(jìn)入到半胱氨酸的合成中。而OASS能利用半胱氨酸生物合成體系,以親核試劑和硫醇代替各種S2-合成非蛋白質(zhì)氨基酸[26-27]。目前已有研究報道了利用大腸桿菌中重組表達(dá)的OASS合成藥物中間體S-苯基-L-半胱氨酸及L-α-丙氨酸[28],為利用OASS在微生物體內(nèi)合成蒜氨酸提供了參考。

        本研究以烯丙基硫醇為底物,從實驗室保藏的19種酵母菌株中,篩選出一株S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量較高的釀酒酵母CCCG,研究了溫度、初始pH、接種量、裝液量、搖瓶轉(zhuǎn)速、烯丙基硫醇添加量等發(fā)酵條件對釀酒酵母產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸含量的影響,通過單因素試驗和正交試驗,經(jīng)釀酒酵母的發(fā)酵及H2O2的氧化得到蒜氨酸的最佳發(fā)酵條件,為生物法合成蒜氨酸提供了新的思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 菌種

        實驗室保藏釀酒酵母菌株:CGY2、CGY、CCCG、CLS、CCY、CHY、CBY、CGWY、CEPY、CKY、CMY、CRY、BDYD、JYYJS、JYYR、JYFI、GAQ1、GAQ2、

        GAQ4。

        1.1.2 試劑

        葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純):美國Fisher Scientific公司;蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):上海源葉生物科技有限公司;S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、烯丙基硫醇(分析純):上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

        1.1.3 培養(yǎng)基

        斜面培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,瓊脂20 g/L,pH 6.0,在115 ℃下滅菌30 min。

        種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,pH 6.0,在115 ℃下滅菌30 min。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母粉10 g/L,(NH4)2SO48 g/L,KH2PO43 g/L,MgSO40.15 g/L,pH 6.0,在115 ℃下滅菌30 min。

        1.2 儀器與設(shè)備

        LD-20AD高效液相色譜系統(tǒng)(配有SPD-20A紫外檢測器) 日本島津公司;質(zhì)譜引導(dǎo)的高通量自動純化系統(tǒng)(配有電噴霧離子源(ESI)) 沃特世科技(上海)有限公司;WH-2微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 菌種篩選

        分別將活化的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為10%,轉(zhuǎn)速為180 r/min,在30 ℃培養(yǎng)12 h后,加入烯丙基硫醇,繼續(xù)培養(yǎng)19 h。由于S-烯丙基-L-半胱氨酸經(jīng)過H2O2的氧化后即為蒜氨酸,因此先篩選出能產(chǎn)生S-烯丙基-L-半胱氨酸的菌株。培養(yǎng)結(jié)束取樣處理后,利用HPLC測定其中S-烯丙基-L-半胱氨酸的含量,而后在經(jīng)過處理的樣品中加入30% H2O2,持續(xù)攪拌24 h后測定其中蒜氨酸的含量[29-30],篩選出S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸產(chǎn)量較高的菌株,并利用質(zhì)譜法進(jìn)一步驗證所篩選的菌株具有產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸的能力。

        1.3.2 樣品處理

        水分含量測定:菌懸液經(jīng)8000 r/min離心去上清液,無菌水清洗菌體3次,稱取濕菌體重量M1,置于65 ℃烘箱中烘干至恒重,稱取干菌體重量M2。

        (1)

        式中:M1為濕菌體的重量,g/L;M2為干菌體的重量,g/L。

        破壁提取胞內(nèi)S-烯丙基-L-半胱氨酸:菌懸液經(jīng)8000 r/min離心去上清液,無菌水洗滌3次,稱取菌體濕重,重懸濕菌體定容至恒定體積。定容后取適量菌懸液稀釋,于血球計數(shù)板計數(shù),取3次平行計數(shù)結(jié)果。采用超聲破壁法,設(shè)定功率為300 W,于冰浴條件下超聲破碎30 min(設(shè)定工作1 s,間隔1 s)[31- 32],取適量破壁后的菌懸液稀釋,于血球計數(shù)板計數(shù),取3次平行計數(shù)結(jié)果。

        (2)

        式中:N1為破壁前細(xì)胞數(shù);N2為破壁后細(xì)胞數(shù)。

        胞內(nèi)S-烯丙基-L-半胱氨酸含量測定:破壁后的菌懸液經(jīng)8000 r/min離心取上清液,將上清液用微濾膜(0.22 μm)過膜后利用高效液相色譜法計算得到提取液中S-烯丙基-L-半胱氨酸的濃度,最后計算得到每克干細(xì)胞中S-烯丙基-L-半胱氨酸的含量。

        S-烯丙基-L-半胱氨酸干重產(chǎn)量(mg/g)=

        (3)

        1.3.3 S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的定量和定性分析

        1.3.3.1 S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的定量分析

        色譜條件:色譜柱Inertsil ODS SP C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm);流動相甲醇∶甲酸水溶液為5∶95(體積比);紫外檢測波長220 nm;柱溫30 ℃,流速0.8 mL/min,進(jìn)樣量20 μL。

        1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

        分別配制濃度為200,400,600,800,1000 μg/mL的S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。以不同的S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),以HPLC法測定的峰面積數(shù)值為縱坐標(biāo),繪圖得到S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.3.3 S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的定性分析

        質(zhì)譜條件:離子方式:電噴霧正離子化(ESI+);毛細(xì)管電壓3.5 kV;錐孔電壓25 V;離子源溫度100 ℃;脫溶劑氣溫度300 ℃;質(zhì)量掃描范圍100~200 m/z;選擇性離子檢測(SIM)162 m/z和 178 m/z。

        1.3.4 單因素試驗設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵條件

        通過單因素試驗改變發(fā)酵條件,分別考察烯丙基硫醇添加量、初始pH、溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量對S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量的影響,單因素試驗設(shè)計表見表1,按照每個因素分別進(jìn)行試驗研究。

        表1 單因素不同水平試驗設(shè)計表Table 1 Single factor test design at different levels

        1.3.5 正交試驗設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵條件

        在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用七因素三水平,通過正交試驗L18(37)選取最優(yōu)發(fā)酵條件,因素水平設(shè)計表見表2。

        表2 正交試驗因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal test

        2 結(jié)果與分析

        2.1 高效液相色譜法測定S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

        按照1.3.3.1中的方法,在200 μg/mL~1 mg/mL范圍內(nèi),進(jìn)樣量與其峰面積均呈良好的線性關(guān)系,S-烯丙基-L-半胱氨酸的回歸方程為:Y=5496.3X-44949(R2=0.9997),蒜氨酸的回歸方程為:Y=7232.5X+39674(R2=0.9998)。

        2.2 高產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸的菌株的篩選

        通過高效液相色譜法測定15種酵母細(xì)胞合成S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量,結(jié)果表明有10種酵母菌株具有利用烯丙基硫醇合成S-烯丙基-L-半胱氨酸的能力,在產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸的菌株中,有兩株酵母干重產(chǎn)量超過50 mg/g DCW,分別為酵母CCCG和酵母BDYD,干重產(chǎn)量分別為(52.35±0.86) mg/g DCW和(50.16±1.00) mg/g DCW;通過對兩種菌株重復(fù)驗證試驗發(fā)現(xiàn),酵母CCCG合成S-烯丙基-L-半胱氨酸的干重產(chǎn)量明顯高于酵母BDYD,因此選擇釀酒酵母CCCG作為發(fā)酵制備蒜氨酸的菌株。

        圖1 不同酵母菌株S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量Fig.1 S-allyl-L-cysteine yield of different Saccharomyces cerevisiae strains

        2.3 S-烯丙基-L-半胱氨酸及蒜氨酸的定性分析

        對S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)品、酵母CCCG的細(xì)胞破碎液、蒜氨酸標(biāo)品及酵母CCCG的細(xì)胞破碎液經(jīng)雙氧水處理后的樣品分別進(jìn)行ESI-MS分析,進(jìn)一步驗證S-烯丙基-L-半胱氨酸和蒜氨酸的生成,試驗結(jié)果見圖2和圖3。

        圖2 S-烯丙基-L-半胱氨酸電噴霧電離源-質(zhì)譜圖Fig.2 ESI-MS of S-allyl-L-cysteine

        由圖2中a和b可知,S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)品和酵母CCCG的細(xì)胞破碎液的準(zhǔn)分子離子流圖均在3.42 min左右出峰。由圖2中c可知,酵母CCCG的細(xì)胞破碎液在3.42 min處出現(xiàn)m/z=162.25,為S-烯丙基-L-半胱氨酸的準(zhǔn)分子離子[M+H]+,因此確定酵母CCCG具有合成S-烯丙基-L-半胱氨酸的能力。

        圖3 蒜氨酸電噴霧電離源-質(zhì)譜圖Fig.3 ESI-MS of alliin

        由圖3中a和b可知,蒜氨酸標(biāo)品和酵母CCCG的細(xì)胞破碎液經(jīng)H2O2處理后的準(zhǔn)分子離子流圖均在2.88 min左右出峰。由圖3中c可知,酵母CCCG的細(xì)胞破碎液經(jīng)H2O2處理后的樣品在2.887 min處出現(xiàn)m/z=178.00,為蒜氨酸的準(zhǔn)分子離子[M+H]+,確定了產(chǎn)物蒜氨酸的生成。

        2.4 發(fā)酵條件對S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量的影響

        不同發(fā)酵條件對S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量的影響見圖4 。

        圖4 不同發(fā)酵條件對S-烯丙基-L-半胱氨酸干重產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different fermentation conditions on dry weight yield of S-allyl-L-cysteine

        由圖4中a可知,溫度在20~30 ℃時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量隨著溫度的升高而增加,在30 ℃時達(dá)到最大,為(57.7±1.65) mg/g DCW,但發(fā)酵溫度繼續(xù)升高,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降,可能是由于溫度過高,發(fā)酵過程中添加的一部分烯丙基硫醇未反應(yīng)就已經(jīng)分解,從而降低了S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量。

        由圖4中b可知,當(dāng)pH在4~6之間時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量逐漸增加,當(dāng)pH為6時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大,約為(58±1.44) mg/g DCW,pH繼續(xù)升高,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降,可能是由于pH過高影響了酵母的生長,從而影響了S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量。

        由圖4中c可知,當(dāng)接種量在6%~10%之間時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量隨著接種量的增加而增加,當(dāng)接種量為10%時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大,為(56.2±0.89) mg/g DCW,當(dāng)接種量繼續(xù)增大時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量減少,可能是因為接種量較少時,菌體的對數(shù)生長期會延長,導(dǎo)致處于生長繁殖期的菌體的發(fā)酵能力較差,S-烯丙基-L-半胱氨酸的合成不夠,接種量較大時,發(fā)酵時間縮短,降低了S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量,因此選取接種量10%為最佳。

        由圖4中d可知,搖瓶轉(zhuǎn)速在140~180 r/min時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量逐漸增加,當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降,故確定最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min。

        由圖4中e可知,裝液量在25~50 mL之間時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量逐漸增加,當(dāng)裝液量在50 mL時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量最大,為(60.2±0.9) mg/g DCW,裝液量繼續(xù)增加,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降,因此確定最佳裝液量為50 mL。

        2.5 烯丙基硫醇添加量對S-烯丙基-L-半胱氨酸產(chǎn)量的影響

        由圖5可知,當(dāng)烯丙基硫醇添加量在0.5~1.5 mL之間時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量隨著烯丙基硫醇添加量的增加而增加,當(dāng)烯丙基硫醇添加量為1.5 mL時,S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大,為(53.6±1.43) mg/g DCW,可能是由于烯丙基硫醇添加量過大時,會影響菌體的生長,從而導(dǎo)致S-烯丙基-L-半胱氨酸的產(chǎn)量下降,因此確定最佳的烯丙基硫醇添加量為1.5 mL。

        圖5 烯丙基硫醇添加量對S-烯丙基-L-半胱氨酸干重產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of allyl mercaptan addition amount on dry weight yield of S-allyl-L-cysteine

        2.6 正交試驗結(jié)果及分析

        正交試驗結(jié)果分析見表3。

        表3 L18(37)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 L18(37) orthogonal test design and results

        續(xù) 表

        由表3可知,6個因素的影響程度由高到低為溫度>烯丙基硫醇添加量>搖瓶轉(zhuǎn)速>裝液量>接種量>初始pH,最優(yōu)水平組合為A2F2C2E2D3B1,正交試驗方差分析結(jié)果見表4。

        表4 正交試驗方差分析結(jié)果Table 4 The variance analysis results of orthogonal test

        由表4可知,溫度和烯丙基硫醇添加量均為顯著因素,其中溫度的顯著性大于烯丙基硫醇添加量的顯著性,正交試驗R2=0.938,說明試驗中有93.8%的數(shù)據(jù)可信。

        2.7 正交驗證試驗

        對S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)品、經(jīng)試驗驗證最優(yōu)組合得到的酵母細(xì)胞CCCG的細(xì)胞破碎液、蒜氨酸標(biāo)品及細(xì)胞破碎液經(jīng)雙氧水處理后的樣品分別進(jìn)行HPLC分析,試驗結(jié)果見圖6和圖7。

        圖6 S-烯丙基-L-半胱氨酸高效液相色譜圖Fig.6 HPLC of S-allyl-L-cysteine

        由圖6可知,S-烯丙基-L-半胱氨酸標(biāo)品的出峰時間為11.148 min,細(xì)胞破碎液在11.20 min出峰,與標(biāo)品出峰時間相近,證明有產(chǎn)物S-烯丙基-L-半胱氨酸的生成。

        圖7 蒜氨酸高效液相色譜圖Fig.7 HPLC of alliin

        由圖7可知,蒜氨酸標(biāo)品的出峰時間為5.336 min,細(xì)胞破碎液在5.36 min出峰,與標(biāo)品出峰時間相近,證明有產(chǎn)物蒜氨酸的生成。

        經(jīng)方差分析得到的最優(yōu)組合為A2B1C2D3E2F2,經(jīng)試驗驗證最優(yōu)組合的S-烯丙基-L-半胱氨酸干重產(chǎn)量為(136.01±0.88) mg/g DCW,正交試驗中最佳組合A2B1C2D3E3F2的試驗結(jié)果為(128.29±0.67) mg/g DCW,經(jīng)H2O2氧化后得蒜氨酸的干重產(chǎn)量為(68.281±0.93) mg/g DCW。綜合k值和正交試驗方差分析結(jié)果可知,利用釀酒酵母產(chǎn)蒜氨酸的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B1C2D3E2F2,即培養(yǎng)溫度為30 ℃,初始pH為5,搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min,接種量為10%,裝液量為50 mL/250 mL,烯丙基硫醇添加量為1.5 mL。

        3 結(jié)論

        蒜氨酸作為一種天然活性物質(zhì),性質(zhì)穩(wěn)定、生物活性高且安全無毒,其受熱分解能產(chǎn)生多種具有特殊風(fēng)味和生物活性的含硫化合物[33]。酵母作為國際上公認(rèn)的安全的食品級微生物,其抽提物也是一種純天然和營養(yǎng)的食品輔料[34-35]。因此,利用釀酒酵母發(fā)酵制備蒜氨酸在天然植物防腐保鮮劑、食品調(diào)味劑、保健品等方面具有極大的應(yīng)用潛力。

        本研究以烯丙基硫醇為底物,從19種酵母中篩選出能產(chǎn)生S-烯丙基-L-半胱氨酸的菌株,并通過H2O2的氧化作用,產(chǎn)生蒜氨酸,通過ESI-MS和HPLC法驗證了產(chǎn)物的生成。通過單因素和正交試驗對產(chǎn)S-烯丙基-L-半胱氨酸的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,得最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時間19 h,發(fā)酵溫度30 ℃,接種量10%,初始pH 5,搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min,裝液量50 mL/250 mL,烯丙基硫醇添加量1.5 mL,在此條件下,經(jīng)H2O2的氧化作用,蒜氨酸的干重產(chǎn)量為(68.281±0.93) mg/g DCW,比優(yōu)化前提高了1.96倍。本研究利用蒜氨酸在植物體內(nèi)的生物合成途徑,以烯丙基硫醇為底物,作用于釀酒酵母CCCG的相關(guān)代謝途徑中,實現(xiàn)了蒜氨酸的生物合成,為生物法合成蒜氨酸的研究提供了數(shù)據(jù)參考。后續(xù)研究將從代謝途徑的調(diào)控入手,通過補料分批發(fā)酵提高底物的利用率以及由底物烯丙基硫醇直接發(fā)酵合成蒜氨酸;尋找替代外加H2O2氧化的方法,以期提高S-烯丙基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蒜氨酸的轉(zhuǎn)化率,進(jìn)一步優(yōu)化生物法合成蒜氨酸的工藝。

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