趙承鑫，李艾蒙，楊小云，田其明，鐘定江，賈利蓉*

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065；2.麻江縣明洋食品有限公司，貴州 凱里 556000)

白酸湯起源于貴州省黔東南苗族侗族自治州，是一種以米湯為原料的發(fā)酵調(diào)味品，富含以乳酸為主的多種有機(jī)酸[1]，因其滋味爽口且益于健康而深受當(dāng)?shù)厝藗兿矏?。白酸湯具有增進(jìn)食欲、清熱解暑、助消化、維持腸道穩(wěn)態(tài)、抗氧化、防衰老、抑菌消炎等多種保健功能[2]。白酸湯發(fā)酵的主要功能菌種是乳酸菌，其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各類有機(jī)酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物能夠賦予酸湯獨特的風(fēng)味[3]。研究顯示，人體攝入的大部分乳酸菌在通過消化道進(jìn)入腸道之前, 會因不耐受胃酸環(huán)境而死亡,只有少數(shù)耐酸性乳酸菌能夠通過胃酸屏障。乳酸菌要發(fā)揮益生作用就需要順利通過胃液進(jìn)入腸道，并在腸道定植后達(dá)到一定的數(shù)量[4-5]，故乳酸菌食品的益生功效與其能否適應(yīng)胃腸道的低酸性環(huán)境和高膽鹽濃度有關(guān)。

目前國內(nèi)對于貴州凱里白酸湯的研究大多側(cè)重于其營養(yǎng)物質(zhì)[6]、風(fēng)味成分[7]、工藝優(yōu)化[8-9]、微生物區(qū)系以及微生物對酸湯品質(zhì)的影響[10-12]等，對酸湯源乳酸菌的研究較少。對乳酸菌胃腸道耐受性的研究主要集中于酸菜源乳酸菌[13-14]、泡菜源乳酸菌[15-16]耐酸性測定，而對白酸湯源乳酸菌產(chǎn)酸能力和耐酸性的相關(guān)研究尚未見報道。本試驗旨在從貴州凱里白酸湯中分離菌株，為白酸湯中乳酸菌的進(jìn)一步研究和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

凱里白酸湯：貴州凱里麻江縣明洋食品有限公司。

1.2 試劑

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基(均為生物試劑)：青島高科技工業(yè)園區(qū)海博生物技術(shù)有限公司；平板計數(shù)瓊脂(生物試劑)：上海博微生物科技有限公司；氯化鈉(分析純)：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；碳酸鈣、鹽酸(均為分析純)：成都科隆化學(xué)品有限公司；胃蛋白酶(分析純)：上海泰坦科技股份有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

電熱式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SPX-150B III生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DW-2菌落計數(shù)器 杭州大微生物技術(shù)有限公司；H2-16KR臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；pH計 上?？祪x儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 白酸湯樣品中乳酸菌的分離純化

從發(fā)酵時間為3，6，7，8，10 d的白酸湯樣品中各取1 mL，用8.5 g/L的生理鹽水稀釋至10-7，各吸取0.5 mL稀釋液接種于含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)48 h，不同發(fā)酵時間分別做2個平行。觀察菌落形態(tài)，選取呈圓形、表面微白色、濕潤、邊緣整齊、溶鈣圈較大的菌落，挑取單菌落在MRS平板上反復(fù)劃線3～4次，直至獲得21個純菌落平板。并將純化后的菌株于4 ℃保藏。

1.4.2 菌種鑒定

分別從上述純菌落平板上挑取21個單菌落，接種培養(yǎng)于含有10 mL葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基的無菌離心管中，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，不同純菌落各做2個平行，分別標(biāo)記為L(單數(shù)，用作正式樣品)、M(雙數(shù)，用作備份樣品)。離心管用蒸餾水配平，在8000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心12 min，棄去上清液，獲得菌體沉淀。使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和142R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA 基因區(qū)域擴(kuò)增，20 μL PCR 體系包括2 μL 10×Ex Taq buffer, 0.2 μL 5u Ex Taq, 1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix,1 μL 5p Primer 1,1 μL 5p Primer 2, 0.5 μL DNA 模板，補(bǔ) ddH2O 至 20 μL；擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)25次；72 ℃延伸10 min；使用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Sanger測序，利用Sanger測序獲得的兩端raw sequence分別進(jìn)行質(zhì)控，去除低質(zhì)量的堿基，獲得clean sequence后進(jìn)行拼接，獲得組裝序列，與NT數(shù)據(jù)庫Blast獲得物種相似度前十的物種信息，并且選擇相似度最高的比對物種作為菌鑒的結(jié)果，以鑒定到種。

1.4.3 菌種活化擴(kuò)增及菌懸液制備

從已鑒定出的純菌種中抽選3株不同菌種菌株，分別接種到含有15 mL MRS肉湯掊養(yǎng)基的無菌離心管中，36 ℃下培養(yǎng)24 h。離心管用無菌水配平，在6000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心8 min，棄去上清液后用無菌生理鹽水洗滌，并稀釋至15 mL，備用。將上述菌液各取1 mL稀釋至10-7,10-8,10-9后涂布于平板計數(shù)瓊脂上，設(shè)置一組平行及空白，同時將菌液密封，放入4 ℃環(huán)境中抑制其繼續(xù)增殖；將平板放入36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出讀數(shù)。根據(jù)活菌計數(shù)結(jié)果，用無菌生理鹽水將3株菌稀釋至1.00×109CFU/mL，制成菌懸液備用。

1.4.4 不同種乳酸菌的產(chǎn)酸能力測定

取1 mL菌懸液按表1方式接種，空白組接入1 mL無菌生理鹽水，于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并控制培養(yǎng)相應(yīng)時間[17]，發(fā)酵液總酸度的測定參考GB 12456-2021中的酸堿指示劑滴定法對樣品進(jìn)行測定。

表1 接種方式Table 1 Inoculation methods

1.4.5 不同種乳酸菌的耐酸性測定

用蒸餾水稀釋鹽酸，分別調(diào)節(jié)pH值至1.5，2.5，按照1∶100(g/mL)的比例加入胃蛋白酶，充分溶解后用0.20 μm的微孔濾膜過濾。吸取1 mL制備好的菌懸液于9 mL人工胃液中，另取1 mL菌懸液于9 mL蒸餾水中作為對照，混勻后在36 ℃下培養(yǎng)，采用平板涂布計數(shù)法，選取合適的稀釋梯度分別測定1，2，3 h時的活菌數(shù)，每個時間段做兩組平行，取平均值。對照組僅測定0 h時即初始的活菌數(shù)。按下式計算乳酸菌存活率：

式中：S表示存活率，%；N1表示胃酸處理3 h后的最終活菌數(shù)，CFU/mL;N2表示胃酸處理0 h時的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以平均值表示，并采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)軟件和OriginPro 2021進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)鑒定獲得7株純菌株，Blast的比對結(jié)果見表2。

表2 7株分離乳酸菌的Sanger測序分析結(jié)果Table 2 Sanger sequencing analysis results of seven strains of isolated lactic acid bacteria

由表2可知，根據(jù)同源性比對，可判定菌株L7、L9、L15、L19、L29均屬于副干酪乳桿菌，菌株L17屬于干酪乳桿菌，菌株L31屬于植物乳桿菌。后續(xù)選擇表2中同源性最高的L7(Lactobacillusparacasei)、L17(Lactobacilluscasei)、L31(Lactobacillusplantarum)3株菌進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行產(chǎn)酸能力及酸耐受性測定實驗。

2.2 白酸湯中不同種乳酸菌的產(chǎn)酸能力測定

產(chǎn)酸能力是乳酸菌的一個主要特征，產(chǎn)酸機(jī)制日益受到重視[18]。乳酸菌通過代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸、琥珀酸和檸檬酸等有機(jī)酸，這些有機(jī)酸既能幫助調(diào)節(jié)腸道pH及菌群平衡、抑制腸道病原菌[19]，同時也能提高腸胃中酶的活力，幫助吸收營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)腸道功能[20]。因此，在實際的工業(yè)生產(chǎn)中，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌往往具有更高的應(yīng)用價值。3株乳酸菌發(fā)酵不同時間，發(fā)酵液的總酸度見表3。

表3 3株乳酸菌發(fā)酵液總酸度Table 3 Total acidity of fermentation broth of three strains of lactic acid bacteria

由表3可知，3株菌在培養(yǎng)階段總酸度不斷增加，產(chǎn)酸顯著，空白組酸度波動較小，證明培養(yǎng)過程沒有受到雜菌影響。0～8 h副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17酸度增長迅速，8～16 h增速減緩，16～24 h趨于平穩(wěn)；植物乳桿菌L31在0～8 h產(chǎn)酸量少，8～16 h產(chǎn)酸迅速，16～24 h趨于平穩(wěn)。在0～24 h培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)時間對菌液總酸度有顯著影響(p<0.05)。

以發(fā)酵液總酸度減去空白組培養(yǎng)基的酸度，算作菌株的產(chǎn)酸量，3株菌在不同時間段的產(chǎn)酸量比較見圖1。將數(shù)據(jù)進(jìn)行以菌種為變量的單因素顯著性差異分析，以檢驗不同菌種在同一時間的產(chǎn)酸量是否存在差異。

圖1 不同菌株產(chǎn)酸能力Fig.1 Acid-production capacity of different strains

將產(chǎn)酸階段分為0～8 h，8～16 h，16～24 h，每個階段3株菌的產(chǎn)酸速率見圖2。將數(shù)據(jù)進(jìn)行以菌株為變量的單因素顯著性差異分析，以檢驗不同菌株在同一時間段的產(chǎn)酸速率是否存在差異。

圖2 不同菌株產(chǎn)酸速率對比圖Fig.2 Comparison of acid-production rates of different strains

由圖1和圖2可知，3株菌在培養(yǎng)過程中持續(xù)產(chǎn)酸，且在24 h培養(yǎng)結(jié)束后，還有產(chǎn)酸趨勢；其中副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量相近，在培養(yǎng)前8 h產(chǎn)酸最快，8～16 h速率幾乎減半，16～24 h速率顯著降低并趨于平衡；而植物乳桿菌L31則在0～8 h產(chǎn)酸速率較低，8～16 h產(chǎn)酸最為迅速，產(chǎn)酸量也反超副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17，在16～24 h階段速率降低并趨于平衡；植物乳桿菌L31的最大產(chǎn)酸速率及產(chǎn)酸量均大于另外兩株菌。以菌種為變量分別對產(chǎn)酸量及產(chǎn)酸速率進(jìn)行顯著性差異分析，得出結(jié)果：菌株的差異會對產(chǎn)酸量及產(chǎn)酸速率產(chǎn)生影響。植物乳桿菌L31的產(chǎn)酸特性與干酪乳桿菌L17、副干酪乳桿菌L7存在顯著差異；干酪乳桿菌L17與副干酪乳桿菌L7產(chǎn)酸特性相近。干酪乳桿菌L17和副干酪乳桿菌L7產(chǎn)酸主要集中在前8 h,而植物乳桿菌L31在8～16 h有突出的產(chǎn)酸優(yōu)勢。總體產(chǎn)酸效果：植物乳桿菌L31>干酪乳桿菌L17>副干酪乳桿菌L7。

2.3 白酸湯中不同種乳酸菌的耐酸性測定

酸湯發(fā)酵過程中pH值在3.0～4.0之間波動，人體胃液中胃酸的主要成分為鹽酸，純胃酸的pH值約為0.9，正常胃液的pH值為2.0～3.5[21]，進(jìn)食后胃液會被稀釋，pH值甚至上升至3.5[22]，比酸湯發(fā)酵的酸度更低。因此，僅少數(shù)具有良好耐酸能力的乳酸菌可以通過胃酸屏障。已知乳酸菌的耐酸機(jī)制有許多種，主要包括酸耐受反應(yīng)機(jī)制、質(zhì)子泵理論等[23]。由于食物在胃中通過的時間一般低于3 h，液體食物通過的時間更短，因此耐酸性試驗選擇1.5，2.5這2個pH值下培養(yǎng)試驗菌3 h，于10-7，10-8兩個稀釋梯度下觀察其存活情況。

乳酸菌耐酸性測定試驗中，存活情況見表4。

表4 白酸湯中乳酸菌在人工胃液條件下的存活率Table 4 Survival rates of lactic acid bacteria in rice sour soup under the condition of artificial gastric juice

將數(shù)據(jù)進(jìn)行以pH為變量的單因素顯著性差異分析，以檢驗同一菌株相同培養(yǎng)時間但不同pH下的存活狀態(tài)差異，各試驗菌株在人工胃液中的存活情況見圖3中A～C，圖中不同字母表示差異性顯著(p<0.05)。將數(shù)據(jù)進(jìn)行以菌株為變量的單因素顯著性差異分析，以檢驗不同菌株同一pH下培養(yǎng)3 h后的存活率差異，見圖3中D。

A

B

C

D

由表4和圖3可知，3株乳酸菌對人工胃液表現(xiàn)出了不同程度的耐受能力，且同一菌株相同pH條件下的初始菌落數(shù)和最終菌落數(shù)差異性顯著(p<0.05)，同一菌株相同時間不同pH條件下的活菌數(shù)差異也較大，不同菌株相同pH條件下的最終存活率也有一定差異，說明菌種或菌株的不同、生存環(huán)境的變化都會對其酸耐受性造成影響?？傮w上活菌數(shù)都隨著培養(yǎng)時間的延長和pH的降低而逐漸減少，說明胃液會對乳酸菌造成一定程度的影響。副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17在pH為1.5的人工胃液中培養(yǎng)3 h后存活率為0，菌株L7、L17在pH 2.5的條件下培養(yǎng)3 h后存活率分別為22.97%、37.50%，存活率較低，說明這兩株菌對惡劣酸性環(huán)境的耐受性較差，其中菌株L7的酸耐受性能最差。植物乳桿菌L31在pH 1.5的人工胃液中培養(yǎng)3 h后存活率僅為9.40%，但在pH 2.5的條件下培養(yǎng)3 h后存活率高達(dá)72.62%，說明該菌株的耐酸性較前兩者更強(qiáng)，但同樣較難在極端酸性條件下生存。溫賀等[24]測定了1株酸菜源植物乳桿菌在pH 3.0條件下的存活率為55%，由此可見，本實驗的植物乳桿菌L31菌株耐酸能力更強(qiáng)。比較3株乳酸菌的產(chǎn)酸能力和耐酸性，植物乳桿菌L31的產(chǎn)酸能力和耐酸性都強(qiáng)于其他兩株菌(L7、L17)，由此可見，耐酸能力強(qiáng)的菌株其產(chǎn)酸能力也較強(qiáng)，這與白友菊[25]研究得出的結(jié)論相似。3株菌在pH 2.5條件下,3 h后活菌數(shù)都保持在107CFU/mL以上，而乳酸菌發(fā)揮益生作用的最低活菌數(shù)目為106CFU/mL，這說明當(dāng)攝入數(shù)量級為108CFU/mL的酸湯源乳酸菌時，3株乳酸菌均能夠通過非空腹情況下的胃酸屏障并有機(jī)會在胃腸道中存活并發(fā)揮益生作用。

3 結(jié)論

本試驗從貴州凱里白酸湯中分離提純出7株乳酸菌，通過Sanger測序鑒定出5株副干酪乳桿菌、1株干酪乳桿菌以及1株植物乳桿菌，對其中3株不同種的乳酸菌(副干酪乳桿菌L7、干酪乳桿菌L17、植物乳桿菌L31)進(jìn)行產(chǎn)酸能力和耐酸性測定，3株菌均具有良好的產(chǎn)酸能力，其中植物乳桿菌L31的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，且產(chǎn)酸時間點集中；而副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17的產(chǎn)酸量及產(chǎn)酸速率相近，產(chǎn)酸時間長，更易控制產(chǎn)酸進(jìn)度。3株不同種的乳酸菌的耐酸性測定實驗表明，在正常胃液酸度pH 2.5下，3株菌均能存活且有幾率進(jìn)入腸道發(fā)揮益生作用，其中酸耐受性強(qiáng)弱順序為植物乳桿菌L31>干酪乳桿菌L17>副干酪乳桿菌L7；而在空腹胃液酸度pH 1.5下，僅菌株L31能夠存活，且存活率較低，但依然能夠達(dá)到乳酸菌發(fā)揮益生作用的最低活菌數(shù)目，反映出植物乳桿菌L31具有較好的酸耐受性，有進(jìn)一步開發(fā)的價值。本研究為白酸湯中乳酸菌的開發(fā)和利用奠定了理論基礎(chǔ)。