李玉梅，林海濤*，李淋倍，趙心雨，鄭祚福

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣東江門中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，廣東 江門 529080)

蠶絲的主要成分是絲素蛋白，絲素蛋白是一種具有內(nèi)在特性的蛋白質(zhì)，是一種天然高分子材料[1-2]。傳統(tǒng)上，絲素蛋白主要是作為紡織纖維原料使用。近年來(lái)人們對(duì)絲素蛋白的興趣急劇增加[3-7]，不斷拓寬絲素蛋白的研究領(lǐng)域，其主要被應(yīng)用在食品、化妝品、醫(yī)用材料、臨床診斷治療、環(huán)境保護(hù)及生物制藥等不同領(lǐng)域。在食品領(lǐng)域，目前需要解決的問(wèn)題之一是如何最大程度地利用絲素蛋白。絲素蛋白因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，非常堅(jiān)韌，難以水解[8]。因此，本文選用6種蛋白酶水解絲素蛋白，從中選出水解條件最好的蛋白酶，再進(jìn)行水解條件的優(yōu)化，達(dá)到充分水解絲素蛋白的目的。

食品添加劑能改善食品的色、香、味等，從而增加人們的食欲；還可應(yīng)用于食品的保鮮和防腐，提高食品生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益[9-12]。隨著時(shí)代的發(fā)展，食品添加劑在現(xiàn)代食品工業(yè)中逐漸變得不可或缺，但過(guò)量使用食品添加劑會(huì)危害人們的健康，因此國(guó)家對(duì)食品添加劑的使用范圍做出了嚴(yán)格的規(guī)范[13-14]。本文主要研究絲素肽的最佳工藝條件，以便將其應(yīng)用于食品添加劑或功能性食品等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑蠶繭：廣西鹿寨縣貴盛繭絲工貿(mào)有限公司；鹽酸(AR)：西隴化工股份有限公司；無(wú)水乙醇(AR)：成都市科隆化學(xué)品有限公司；堿性蛋白酶：河南仰韶生物科技有限公司；NaOH(AR)、甲醇(AR)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶：和氏璧生物科技有限公司；菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

UPT-I-10T實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī) 四川優(yōu)普超純科技有限公司；Y(B)802N八籃恒溫烘箱 溫州大榮紡織儀器有限公司；H1850R醫(yī)用離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；YB71丹尼爾電子天平 常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 上海力辰邦西儀器科技有限公司；LGJ-10D冷凍干燥機(jī) 上海諾頂儀器設(shè)備有限公司；堿式滴定管 上海帥登儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器 鄭州生元儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 pH-stat法[15]測(cè)定水解度

蛋白質(zhì)水解過(guò)程中存在著質(zhì)子，質(zhì)子有兩種狀態(tài)：一種是吸收，另一種是釋放。在水解過(guò)程中加入堿或酸使pH保持不變，質(zhì)子就會(huì)發(fā)生變化，因此，能通過(guò)消耗堿的量，得到水解度。

式中：B表示維持pH值不變消耗堿的量，mL；Nb表示實(shí)驗(yàn)中配制的堿濃度，mol/mL；a=10pH-pK/(1+10pH-pK)，其中pH是加入堿后維持不變的值，pK=7.0；a表示氨基的平均解離度；m表示絲素蛋白溶液中總蛋白質(zhì)含量，g；htot表示絲素蛋白溶液中蛋白質(zhì)的肽鍵總數(shù)，mmol/g，htot=12.4 mmol/g。

1.3.2 甲醇滴定法測(cè)定水解度

向絲素蛋白溶液中加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解3 h。此時(shí)酶解液中還存在酶的活性，需要在100 ℃的沸水中進(jìn)行滅酶20 min，得到失活的酶解液，用移液槍移取失活的酶解液5.0 mL于燒杯中，用量筒稱取60 mL去離子水于裝有酶解液的燒杯中。將燒杯置于磁力旋轉(zhuǎn)器上，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。用pH計(jì)將pH值調(diào)為7，用量筒稱取中性甲醇溶液10 mL，倒入燒杯，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)混勻。配制氫氧化鈉溶液，用堿式滴定管滴定到數(shù)值為9.2，記錄滴定到數(shù)值為9.2消耗氫氧化鈉溶液的體積數(shù)為V1(mL)。

用移液槍移取絲素蛋白溶液5.0 mL置于燒杯中，用量筒稱取60 mL去離子水于裝有絲素蛋白溶液的燒杯中。將燒杯置于磁力旋轉(zhuǎn)器上，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。用pH計(jì)將pH值調(diào)為7，用量筒稱取中性甲醇溶液10 mL，倒入燒杯，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)混勻。用堿式滴定管滴定到數(shù)值為9.2，記錄滴定到數(shù)值為9.2的絲素蛋白溶液消耗氫氧化鈉溶液的體積數(shù)為V2(mL)。

DH(%)=M(V1-V2)×(1000/CWOV)×(1/htot)×100%。

式中：M表示實(shí)驗(yàn)中配制的堿濃度，mol/L；V1表示滴定到數(shù)值為9.2的酶解液消耗的氫氧化鈉溶液的體積數(shù)，mL；V2表示滴定到數(shù)值為9.2的絲素蛋白溶液消耗氫氧化鈉溶液的體積數(shù)，mL；CWO表示絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度，g/L；V表示中性甲醇溶液的體積數(shù)，mL；htot表示絲素蛋白溶液中蛋白質(zhì)的肽鍵總數(shù)，mmol/g，htot=12.4 mmol/g。

1.3.3 蛋白酶的選擇

根據(jù)經(jīng)濟(jì)和適用的情況，絲素蛋白水解主要選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶這6種酶。配制一定濃度的絲素蛋白溶液，100 ℃加熱5 min，加入酶，用1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至所需的pH值，最適溫度下反應(yīng)一定時(shí)間。以水解度大小為指標(biāo)，獲得最佳適用酶。蛋白酶的最適條件見(jiàn)表1。

表1 6種蛋白酶的反應(yīng)條件Table 1 Reaction conditions of six proteases

1.3.4 絲素蛋白酶解反應(yīng)的單因素實(shí)驗(yàn)

在酶解反應(yīng)中，為了使酶解反應(yīng)充分進(jìn)行，需要篩選合適的酶解條件。底物濃度、pH、酶解時(shí)間、溫度、加酶量這5個(gè)因素都會(huì)影響酶解的效果。因而進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，首先固定酶解時(shí)間為3 h、底物濃度為3%、加酶量為10000 U/g、pH為10，改變溫度，設(shè)定為40，45，50，55，60，65 ℃測(cè)水解度，水解度越高越好，選水解度最高的溫度做下一個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)；酶的活性部位對(duì)反應(yīng)體系pH的變化較為敏感，設(shè)定pH為7，8，9，10，11，12測(cè)水解度，最適的pH值能使酶表現(xiàn)出最大的催化功能；加酶量增加，水解度增加，設(shè)定加酶量為7000，8000，9000，10000，11000，12000 U/g測(cè)水解度，最佳的加酶量酶解效果最好；底物濃度的高低直接影響水解度，設(shè)定底物濃度為1%、2%、3%、4%、5%、6%測(cè)水解度；固定加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10、底物濃度為2%，改變酶解時(shí)間，設(shè)定為30，60，90，120，150，180 min測(cè)水解度，選擇獲得產(chǎn)物最多的酶解時(shí)間。

1.3.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化絲素蛋白酶解條件的研究

選好蛋白酶的種類后，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)底物濃度和pH對(duì)酶解效果的影響很小，因此選用溫度、加酶量、酶解時(shí)間做正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2。

表2 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(33) orthogonal test

底物絲素蛋白溶液與酶在恒溫水浴鍋中不斷反應(yīng)，使pH值一直保持在實(shí)驗(yàn)規(guī)定的范圍內(nèi)。水解反應(yīng)終止時(shí)，放入滾燙的熱水100 ℃煮沸20 min，冷卻后，用移液槍移取失活后的酶解液測(cè)水解度。酶解液以10000 r/min的速度離心20 min，獲得上清液和沉淀物，將上清液用冷凍干燥機(jī)制成絲素肽粉末。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 傅里葉紅外光譜(FTIR)測(cè)試分析

取絲素在最佳酶解工藝條件下得到的肽液，進(jìn)行冷凍干燥，干燥48 h，制成粉末，粉末與溴化鉀按1∶100的比例進(jìn)行混合，放入模具，用壓片機(jī)壓成片，用紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試。

1.4.2 表面形貌觀察

采用日立S-570型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察冷凍干燥制備的絲素肽粉的形態(tài)結(jié)構(gòu)。用牙簽將絲素肽粉粘貼在圓臺(tái)上，進(jìn)行噴金處理，或者將酶解后的絲素肽液進(jìn)行滅酶離心，取離心后的澄清液滴到載玻片上，置于60 ℃烘箱中烘干。用電子顯微鏡對(duì)烘干后的樣品進(jìn)行形貌觀察。

1.4.3 粒度分布測(cè)試

利用馬爾文激光粒度儀對(duì)絲素在最佳酶解工藝條件下得到的肽液進(jìn)行粒度分布測(cè)試。在粒度分布測(cè)試之前要先測(cè)好樣品的吸光度和折射率。馬爾文激光粒度儀開(kāi)機(jī)后，要先輸入樣品的吸光度和折射率，再進(jìn)行粒度分布測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法對(duì)絲素蛋白水解能力的比較

用甲醛滴定法和pH-stat法測(cè)定6種蛋白酶在最適條件下的水解能力，水解度見(jiàn)圖1～圖6。

在同一底物存在的情況下，不同酶的切割位點(diǎn)不同，而且具有差異性，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物多肽含量不同。用不同的蛋白酶對(duì)絲素蛋白進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，用甲醛滴定法和pH-stat法這兩種方法來(lái)測(cè)定不同蛋白酶對(duì)絲素蛋白的水解度。由圖1可知，甲醛滴定法測(cè)得的水解度比pH-stat法測(cè)得的高，堿性蛋白酶水解度最高，達(dá)到4.7%。因此，選用堿性蛋白酶作為絲素蛋白酶解用酶。

2.2 堿性蛋白酶催化絲素蛋白水解反應(yīng)的研究

2.2.1 溫度對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響

圖2 溫度對(duì)酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis of silk fibroin

溫度對(duì)酶解效果的影響很大，合適的溫度會(huì)加速酶的反應(yīng)，使其迅速溶解，得到更多的樣品。溫度過(guò)高，酶失活，不反應(yīng)，得到的樣品少；溫度過(guò)低，反應(yīng)慢，得到的樣品也少。由圖2可知，在40～45 ℃區(qū)間內(nèi)，水解度緩慢上升，在45～55 ℃區(qū)間內(nèi)，水解反應(yīng)更迅速，水解度上升更快。在55～60 ℃區(qū)間內(nèi)，水解度迅速下降。在60～65 ℃區(qū)間內(nèi)，水解度緩慢下降。從整體上看，水解反應(yīng)的最適溫度為55 ℃。

2.2.2 pH對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響

固定酶解時(shí)間為3 h、底物濃度為3%、加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃，改變pH，設(shè)定為7，8，9，10，11，12，其對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis of silk fibroin by alkaline protease

由圖3可知，pH在7～9區(qū)間內(nèi)，水解反應(yīng)的速度很快，水解度上升迅速。pH在9～10區(qū)間內(nèi)，水解度緩慢上升。pH在10～12區(qū)間內(nèi)，水解度呈下降趨勢(shì)。從整體上看，水解反應(yīng)的最適pH為10。

2.2.3 加酶量對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響

固定酶解時(shí)間為3 h、底物濃度為3%、溫度為55 ℃、pH為10，改變加酶量，設(shè)定為7000，8000，9000，10000，11000，12000 U/g，其對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 加酶量對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of addition amount of enzyme on hydrolysis of silk fibroin by alkaline protease

由圖4可知，加酶量在7000～10000 U/g區(qū)間內(nèi)，水解反應(yīng)的速度很快。加酶量在10000～12000 U/g區(qū)間內(nèi)，水解度緩慢上升，變化不明顯。從整體上看，絲素蛋白水解反應(yīng)的最佳加酶量為10000 U/g。

2.2.4 底物濃度對(duì)絲素蛋白酶解效果的影響

固定酶解時(shí)間為3 h、加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10，改變底物濃度，設(shè)定為1%、2%、3%、4%、5%、6%，其對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 底物濃度對(duì)酶解絲素蛋白效果的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on enzymatic hydrolysis of silk fibroin

由圖5可知，底物濃度在1%～3%區(qū)間內(nèi)，水解度呈下降趨勢(shì)，下降很快。底物濃度在3%～4%區(qū)間內(nèi)，水解度緩慢下降。底物濃度在4%～6%區(qū)間內(nèi)，水解度也在緩慢下降，但下降得不明顯。從整體上看，底物濃度為1%的水解效果最好。但考慮到濃度過(guò)低會(huì)影響生產(chǎn)效率，因此選擇2%為最佳底物濃度。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)絲素蛋白酶解效果的影響

固定加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10、底物濃度為2%，改變酶解時(shí)間，設(shè)定為30，60，90，120，150，180 min，其對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis of silk fibroin by alkaline protease

由圖6可知，酶解時(shí)間在30～180 min區(qū)間內(nèi)，水解度均呈上升趨勢(shì)。為獲得肽含量高的絲素酶解液，選擇120 min作為堿性蛋白酶酶解絲素蛋白的最佳時(shí)間。

2.3 堿性蛋白酶催化絲素蛋白水解反應(yīng)的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化研究

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，由于pH和底物濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響小，選擇溫度(A)、加酶量(B)、酶解時(shí)間(C)3個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 L9(33) orthogonal experiment results

2.4 紅外光譜分析

固定底物濃度為2%、加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10，不同酶解時(shí)間制備的絲素肽粉的紅外光譜圖見(jiàn)圖7。

圖7 酶法制備絲素肽的紅外吸收光譜圖Fig.7 Infrared absorption spectra of silk fibroin peptide prepared by enzymatic method

2.5 絲素肽的表面形貌

對(duì)不同方式制作的SEM測(cè)試樣進(jìn)行觀測(cè)，得到的酶解絲素肽的表面形貌圖見(jiàn)圖8。

圖8 酶解絲素肽SEM圖Fig.8 SEM images of enzymatic hydrolysis of silk fibroin peptide

相互對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍干燥制備的絲素肽顆粒發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，顆粒大且形狀不規(guī)則。由圖8中D～F可以看出絲素肽的粒徑已經(jīng)達(dá)到納米級(jí)。

2.6 粒徑分析

固定底物濃度為2%、加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10，不同酶解時(shí)間制備的絲素肽液的粒徑分布圖見(jiàn)圖9。

圖9 絲素肽液粒度分布圖Fig.9 Particle size distribution of silk fibroin peptide solution

由圖9可知，絲素肽液的粒徑分布基本集中在100～700 nm之間。其中酶解時(shí)間為30 min的絲素肽粉粒度分級(jí)在200～700 nm呈正態(tài)對(duì)數(shù)分布，體積密度在粒度分級(jí)為404 nm左右達(dá)到最大值。酶解時(shí)間為60 min的絲素肽粉粒度分級(jí)在200～500 nm呈正態(tài)對(duì)數(shù)分布，體積密度在粒度分級(jí)為269 nm左右達(dá)到最大值。酶解時(shí)間為90，150 min的絲素肽粉粒度分級(jí)在100～500 nm呈正態(tài)對(duì)數(shù)分布，體積密度在粒度分級(jí)為202 nm左右達(dá)到最大值[18]。

3 結(jié)語(yǔ)

本文以超聲輔助低濃度堿溶解的絲素蛋白溶液為原料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)得出，在最適水解條件下，加酶量為10000 U/g，溫度為55 ℃，pH為10，絲素蛋白溶液底物濃度為2%，酶解150 min后得到水解度為8.55%的絲素肽溶液，絲素肽顆粒大且形狀不規(guī)則。150 min制備的絲素肽粉粒度分級(jí)在100～500 nm呈正態(tài)對(duì)數(shù)分布，體積密度在粒度分級(jí)為202 nm左右達(dá)到最大值。此研究可為制備絲素肽液提供充分的參考依據(jù)。絲素肽含有人體所需的氨基酸，又是一種純蛋白，有降低膽固醇和促進(jìn)酒精代謝的作用，對(duì)免疫性疾病有預(yù)防作用，因此在食品添加劑、功能性食品方面有很高的應(yīng)用價(jià)值。