施生姣，宋維敏，程 亮，魏有海

（1.青海大學, 青海 西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學院, 青海 西寧 810016；3.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室, 青海 西寧 810016；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學觀測實驗站, 青海 西寧 810016；5.青藏高原生物技術教育部重點實驗室, 青海 西寧 810016）

0 引言

【研究意義】豬殃殃、密花香薷、藜等雜草是我國農(nóng)田的重要惡性雜草，繁殖能力強，蔓延擴散快，危害損失重[1-3]，生產(chǎn)中依賴化學除草劑控制其危害。由于化學除草劑長期連續(xù)使用及不合理使用同種或同類除草劑，導致農(nóng)田雜草群落演變加速、抗藥性雜草生物型數(shù)量和程度明顯增加、作物藥害發(fā)生頻繁、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全以及環(huán)境污染加劇等問題凸顯[4-5]，雜草防治難度不斷加大，農(nóng)藥使用量呈上升趨勢。雜草生物防控已引起全球環(huán)保與植保工程科技人員的高度重視。微生物除草劑具有制作原料來源豐富、開發(fā)費用相對較低、對環(huán)境和非靶標生物安全等顯著優(yōu)勢，其高效利用模式研發(fā)及應用對于實現(xiàn)農(nóng)藥減量使用，遏制雜草加重發(fā)生的態(tài)勢，進而實現(xiàn)可持續(xù)的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自然界中的致病菌是微生物除草劑的來源之一[6]，目前已有多個屬的真菌被研發(fā)或登記成為微生物除草劑，用于多種雜草的生物防治。目前世界范圍內(nèi)商品化的微生物除草劑產(chǎn)品有20余種[7]。我國已成功建立多個病原菌與雜草之間的致病體系[8-9]，且研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權的微生物除草劑產(chǎn)品，例如魯寶一號[10]。朱海霞等[11]研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌GD-5對密花香薷及藜的致病性較強，其鮮重防效可達65%以上。鏈格孢HZ-1粉劑對密花香薷及藜在田間環(huán)境下抑制作用顯著[12]。程亮[13]研究發(fā)現(xiàn)生防菌PA-2可通過影響豬殃殃的細胞膜透性導致其死亡而達到生物防除的目的，針對豬殃殃、密花香薷和藜等3種雜草的生防菌主要為真菌，可通過孢子直接侵入或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物以達到控制雜草的目的?！颈狙芯壳腥朦c】酵母菌的次生代謝物生物活性廣泛，主要用于食品發(fā)酵等[14-16]，但目前應用酵母菌進行雜草防除方面的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過3株酵母菌對豬殃殃、密花香薷和藜等3個青海省農(nóng)田優(yōu)勢雜草的生物活性測定及其對青海主要農(nóng)作物的安全性評價并采用形態(tài)學觀察結合ITS序列及26S rDNA序列分析明確3株酵母菌的分類地位，豐富了可用于雜草防控的微生物菌種資源，為該菌株在雜草防控中的研發(fā)與應用提供基礎，可有效減少化學除草劑的使用量，延緩雜草抗藥性生物型的產(chǎn)生和發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雜草：豬殃殃（Galium spuriumL.）、密花香薷（Elsholtzia densaBenth.）、藜（Chenopodium albumL.）種子，于2020年采于青海省農(nóng)林科學院試驗田（36.724 458oN，101.750 661oE）。

作物：燕麥（加燕2號）、小麥（青春38號）、蠶豆（青海13號）、青稞（柴青1號）、油菜（青雜11號）、豌豆（草原26號）和馬鈴薯（青薯9號）。

酵母菌培養(yǎng)采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）：酵母膏 10.0 g·L-1，蛋白胨 20.0 g·L-1，葡萄糖 20.0 g·L-1，瓊脂20.0 g·L-1；酵母菌發(fā)酵采用YPD液體培養(yǎng)基。

1.2 土壤酵母菌分離

采用稀釋涂布法分離西寧市湟中區(qū)溫室辣椒根際土壤酵母菌[17]。取90 mL無菌水加入10 g土樣，制備成土壤懸浮液后將其稀釋至10-3、10-4，吸取200 μL土壤稀釋液涂布于YPD培養(yǎng)基平板上，每個處理設置3個重復。于28 ℃培養(yǎng)3～5 d后挑取顏色形態(tài)不同的單菌落，在YPD平板上純化培養(yǎng)并4 ℃保存。

1.3 具有除草潛力酵母菌菌株篩選

將純化的菌株培養(yǎng)7 d，打取菌餅（直徑0.5 cm）接種至YPD液體培養(yǎng)基中（每250 mL三角瓶100 mL YPD），于 25 ℃、180 r·min-1培養(yǎng) 7 d，發(fā)酵液真空抽濾后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾備用。將雜草幼苗培育至1葉1心時，選取整齊一致的健壯幼苗移栽至43 cm×25 cm×12 cm花盆中，每盆20株，在溫度25 ℃、光照周期12 L/12 D，環(huán)境相對濕度60%～70%的條件下培養(yǎng)。待雜草幼苗長至7～10葉期時，取100 mL發(fā)酵濾液倒入小噴壺中，加入0.5%吐溫-80，將濾液以250 mL·m-2噴施于雜草植株上，噴霧處理后的雜草植株置于上述條件的溫室中培養(yǎng)。每處理重復4次，以只噴無菌加等量吐溫-80的YPD培養(yǎng)液的植株作為對照。于處理7 d后觀察雜草發(fā)病情況，參考文獻[18]記錄密花香薷、藜、豬殃殃的傷害程度。7 d后按下式計算傷害率和鮮重抑制率。

1.4 酵母菌分離菌株對主栽作物安全性測定

將酵母菌株發(fā)酵濾液以250 mL·m-2分別噴霧于3～4葉期的馬鈴薯、青稞、豌豆、小麥、燕麥、蠶豆和油菜上，培養(yǎng)方法同方法1.3。以只接YPD培養(yǎng)液植株為對照，每處理重復4次。7 d后調(diào)查作物受害情況，測定株高和鮮重，計算株高抑制率和鮮重抑制率。參考程亮等[19]的方法記載作物受害程度。

1.5 菌株16-8發(fā)酵液與氯氟吡氧乙酸混用對豬殃殃的除草活性測定

20%氯氟吡氧乙酸乳油（美國陶氏益農(nóng)公司）按推薦劑量750、375、187.5 mL·hm-2設置3個單用及和16-8菌株發(fā)酵液250 mL·m-2混用處理，以菌株16-8發(fā)酵液單用為對照，另設等量清水為空白對照，共計8個處理，每處理10株，每個處理3次重復，隨機排列。于豬殃殃3～4葉期進行噴霧處理，記錄豬殃殃受害癥狀，7、14 d后調(diào)查鮮重防效。

1.6 菌株鑒定

1.6.1 形態(tài)學鑒定 取在YPD平板上培養(yǎng)7 d的酵母菌菌落的孢子，制成臨時玻片，顯微鏡下觀察孢子形態(tài)并拍照。

1.6.2 分子生物學鑒定 DNA提取采用Ezup柱式提取試劑盒[生工工程（上海）股份有限公司]。用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增 ITS 基因序列， 用NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和 NL4 (5′-GGTCCGTGT-TTCAAGACGG-3′)擴增26S rDNA基因序列。PCR反應體系（25 μL）：10×PCR buffer（含 Mg2+） 2.5 μL， 模 板 DNA 0.5 μL，dNTPs 1.0 μL，上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol·L-1），5 U·μL-1Taq酶 0.2 μL，ddH2O 補足至 25 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，送至由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，采用MEGA 7.0軟件以鄰近法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 15.10軟件進行統(tǒng)計分析，顯著性檢驗采用鄧肯氏法（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離及其除草潛力

共獲得8株不同形態(tài)和顏色的酵母菌，對雜草生長的抑制作用程度不同，其中16-8發(fā)酵液對豬殃殃、密花香薷和藜的傷害率分別為90.17%、66.67%和95.00%，鮮重抑制率分別為88.63%、56.90%和78.77%，3種雜草的鮮重均低于對照組，差異顯著（P＜0.05）（表1）；12-6菌株對豬殃殃、密花香薷和藜的傷害率分別為87.50%、75.00%和43.33%，對豬殃殃的鮮重抑制率達75.80%，密花香薷和藜的鮮重抑制率分別為62.72%和43.25%，3種雜草的鮮重與對照組相比，均差異顯著（P＜0.05）；6-3菌株對豬殃殃、密花香薷和藜的傷害率分別為0%、36.67%和41.67%，對3種雜草的鮮重抑制率為9.41%、46.29%和43.46%，豬殃殃和藜的鮮重與對照相比，均差異不顯著（P＞0.05），但密花香薷鮮重低于對照組，差異顯著（P＜0.05），從各個分離菌株看，16-8菌株發(fā)酵液對豬殃殃和藜幼苗生長的抑制作用要高于12-6和6-3菌株發(fā)酵液，但12-6菌株發(fā)酵液對密花香薷幼苗生長抑制作用要高于16-8和6-3菌株發(fā)酵液。

表1 3株酵母菌菌株發(fā)酵液對雜草幼苗生長的抑制作用Table 1 Inhibition effect of yeast fermentation broths on growth of weed seedlings

16-8處理后豬殃殃表現(xiàn)癥狀為植株矮小、葉片輕微失綠、發(fā)黃葉片明顯萎蔫，而12-6處理后，豬殃殃植株表現(xiàn)為矮小、葉片輕微失綠發(fā)黃、萎蔫、植株莖干變細、分蘗數(shù)變少。6-3發(fā)酵液處理7 d后，豬殃殃除表現(xiàn)植株葉片輕微萎蔫之外無其他明顯癥狀，10 d以后傷害癥狀沒有恢復，繼續(xù)加重（圖1-A）。12-6處理條件下的密花香薷植株矮小，葉緣干枯新生葉片向內(nèi)卷曲嚴重，花苞明顯枯焦發(fā)黃、葉面積窄小，10 d后病情持續(xù)加重。16-8處理對密花香薷表現(xiàn)癥狀與12-6相似但傷害較輕。6-3處理的植物略微矮小，花苞枯焦發(fā)黃較12-6、16-8處理較輕，10 d以后傷害癥狀沒有恢復，且繼續(xù)加重（圖1-B）。12-6處理藜表現(xiàn)為1/2葉片有輕微青枯癥狀，1/4葉片邊緣發(fā)黃干枯。16-8處理藜表現(xiàn)為植物矮小、3/4葉片青枯，1/2葉片萎蔫失綠發(fā)黃。6-3處理藜表現(xiàn)為植株略微矮小，葉片邊緣有輕微發(fā)黃，10 d以后傷害癥狀沒有恢復，繼續(xù)加重（圖1-C）

圖1 3株酵母菌發(fā)酵液對多種雜草幼苗生長的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of yeast fermentation broths on growth of weed seedlings

2.2 酵母菌菌株對主栽作物的安全性測定

由表2可知，接種酵母菌發(fā)酵液7 d后，16-8、12-6菌株對燕麥、小麥、青稞、蠶豆、豌豆、油菜和馬鈴薯均沒有傷害，對作物鮮重與株高影響很小，表現(xiàn)對作物安全。6-3菌株對燕麥、小麥、青稞和油菜4種青海主栽作物無傷害，對株高與鮮重無影響，但對蠶豆及豌豆表現(xiàn)出對株高和鮮重有明顯抑制，對蠶豆的株高和鮮重抑制率分別為12.73%和14.73%，對豌豆的株高和鮮重抑制率為10.69%和22.61%（表3）。

表2 3株酵母菌株發(fā)酵液對不同作物的安全性比較Table 2 Effect of yeast fermentation broths on crop safety

表3 3株酵母菌株發(fā)酵液對不同作物抑制作用Table 3 Inhibition effect of yeast fermentation broths on crops （單位：%）

2.3 分離菌株16-8發(fā)酵液與氯氟吡氧乙酸混用對豬殃殃的除草活性測定

16-8菌株發(fā)酵液與化學除草劑氯氟吡氧乙酸混用噴施48 h后，豬殃殃葉片出現(xiàn)萎蔫和部分枯死癥狀，72 h時植株全部枯死；單用發(fā)酵液噴施處理48 h后，豬殃殃植株開始出現(xiàn)萎蔫癥狀，60 h時部分葉片出現(xiàn)枯死，72 h豬殃殃植株全部枯死；如圖2所示，單用化學除草劑750 mL·hm-2時，7 d時萎蔫癥狀明顯，16-8菌株發(fā)酵液與氯氟吡氧乙酸混用處理較其化學除草劑單用處理相比，豬殃殃葉片萎蔫嚴重，出現(xiàn)死亡植株，14 d時抑制程度加重，21 d時豬殃殃已全部枯死。由此可見，16-8菌株發(fā)酵液與氯氟吡氧乙酸混用處理較其發(fā)酵液單用處理相比，豬殃殃葉片枯死癥狀出現(xiàn)早12 h，比單用化學除草劑早5 d。從鮮重抑制率來看，接種20%氯氟吡氧乙酸乳油7 d后，在其供試劑量下對豬殃殃的鮮重抑制率均在65%以下，單用16-8菌株發(fā)酵液處理，鮮重抑制率為85.19%，50%和25%推薦劑量化學除草劑+16-8菌株發(fā)酵液混用的鮮重抑制率分別為85.65%和83.05%；接種后14 d，20%氯氟吡氧乙酸乳油在推薦劑量（750 mL·hm-2）處理時對豬殃殃的鮮重抑制率僅為79.42%，而單用16-8菌株發(fā)酵液處理，鮮重抑制率為89.65%，50%和25%推薦劑量化學除草劑+16-8菌株發(fā)酵液混用的鮮重抑制率分別為91.61%和88.60%，對鮮重進行方差分析可知，單用化學除草劑與混用以及單用16-8菌株發(fā)酵液之間比較，存在顯著性差異，但單用16-8菌株發(fā)酵液與混用處理之間比較，差異不顯著（表4）。

表4 氯氟吡氧乙酸與16-8菌株發(fā)酵液混用對豬殃殃的防效Table 4 Efficacy of 16-8 fermentation broth per se or in combination with fluroxypyr on controlling G.aparine

圖2 除草劑和16-8菌株混用后7 d的除草效果Fig.2 Efficacy of herbicide, 16-8 or herbicide+16-8 on weeds 7 d after treatment

2.4 菌株的鑒定

2.4.1 形態(tài)學鑒定 菌株16-8在YPD培養(yǎng)基上以單菌落出現(xiàn)，菌落邊緣整齊，表面干燥，中間凸起，圓形，顏色為灰白色（圖3-L）。鏡檢結果發(fā)現(xiàn)菌體呈現(xiàn)為圓形、卵圓形（圖3-O）。菌株12-6在YPD培養(yǎng)基上以單菌落出現(xiàn)，菌落邊緣不規(guī)則，表面凸起顏色呈現(xiàn)乳白色（圖3-M）。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)該菌呈現(xiàn)圓形、橢圓形初步鑒定為酵母菌（圖3-P）。菌株6-3在YPD培養(yǎng)基上其菌落乳白色，菌落邊緣規(guī)則不透明，極容易被挑起（圖3-N）。鏡檢結果發(fā)現(xiàn)該菌形態(tài)為圓形、橢圓形（圖3-Q）。

圖3 分離菌株菌落形態(tài)及其孢子顯微觀察Fig.3 Colony morphology and microscopic images of 6-3, 12-6, and 16-8 spores

2.4.2 分子生物學鑒定 以16-8、12-6和6-3菌株基因組為模板，對分離菌株的ITS及26S rDNA基因片段進行PCR擴增與測序。進一步聯(lián)合ITS、26S rDNA基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示（圖4），菌株16-8與Pichia kudriavzevii處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一最小分支，菌株12-6與Kluyveromyces marxianus處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一最小分支，菌株6-3與Meyerozyma guilliermondii處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一最小分支。將16-8、12-6和6-3序列在NCBI上BLAST進行同源對比，并結合形態(tài)學分析結果將16-8鑒定為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），12-6與馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）6-3與季也蒙邁耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）。

圖4 3個菌株（16-8、12-6和6-3）基于ITS及26S rDNA基因構建的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenic NJ trees based on ITS rDNA and 26S rDNA sequences of Strains 16-8, 12-6, and 6-3

3 討論與結論

近年來，微生物的次生代謝產(chǎn)物被開發(fā)為除草劑的研究廣受關注，有研究表明，微生物毒素具有開發(fā)為除草劑的巨大潛力[20-22]。姜述君等[23]研究表明，來源于畫眉草彎孢霉發(fā)酵液中的化合物α, βdehydrocurvularin會影響馬唐葉片新陳代謝繼而導致葉片壞死。Chen等[24]研究結果表明，灰黃青霉的次級代謝產(chǎn)物能有效抑制列當種子的萌發(fā)，從而達到防除惡性寄生性雜草列當?shù)哪康?。本研究發(fā)現(xiàn)3株酵母菌發(fā)酵液對供試雜草的株高和鮮重有明顯的抑制作用，噴霧處理7 d后，16-8菌株對豬殃殃、密花香薷和藜的傷害率分別為90.17%、66.67%和95.00%，鮮重抑制率分別為88.63%、56.90%和78.77%，因此該菌株的發(fā)酵液有較好的開發(fā)為微生物除草劑的潛力。但目前對發(fā)酵液中的具體除草活性物質(zhì)尚不清楚，有待進一步研究。

在微生物除草劑的篩選過程中首要考慮就是安全性問題[25-26]。本研究結果表明，6-3和12-6菌株發(fā)酵液對測試的作物安全，無不良影響。16-8菌株發(fā)酵液除對蠶豆和豌豆株高和鮮重有輕微的影響外，對其他5種作物表現(xiàn)為安全。為全面評價這些菌株的安全性，還應進一步加大其他作物的安全性評價。

微生物在雜草綜合治理中可以有多種不同的應用方式。由于大多數(shù)微生物菌株只針對一種雜草，所以將其與化學除草劑結合使用在理論上是可行的。微生物菌株Myrothecium verrucaria與化學除草劑共同使用可以有效地提高其活性[27]。Song等[28]采用Pyricularia setariae與1/10推薦劑量的烯禾啶混用可以更有效地防治狗尾草。同樣，Phoma proboscis與亞致死劑量的2,4-D混用可以更有效地防治Comvolvulus arvensis[29]。與單獨使用相比，Colletotrichum coccodes與噻苯隆混用可以提高真菌的侵染和苘麻的防除效果[30]。許多化學除草劑僅對剛剛出苗的圓葉錦葵有效，而如果Colletotrichum gloeosporioidsf.sp.malvae與除草劑結合使用，防效可持續(xù)至第4～5片真葉期。與單獨使用真菌或嗪草酮或咪唑乙煙酸相比，二者混用可以極大地提高防治效果，并減少所需藥量[31]。本研究發(fā)現(xiàn)：當16-8菌株發(fā)酵液與25%～50%推薦劑量的氯氟吡氧乙酸混用時，對豬殃殃的鮮重抑制率仍高達88.60%～91.61%，與單獨使用16-8菌株發(fā)酵液的鮮重抑制率相當，表明混用能夠提高單獨使用除草劑或菌株發(fā)酵液的防除效果。因此，可選用微生物菌株與化學農(nóng)藥的復配用于雜草的防除，但在田間的防治效果有待進一步試驗，包括使用劑量、使用方法及最佳使用時間等。同時通過探索與農(nóng)業(yè)防治等其他措施的配合來實現(xiàn)持續(xù)、高效的除草目的。

通過對這3株菌株進行平板上菌落形態(tài)、顯微鏡下孢子形態(tài)觀察，結合分子鑒定，確定這3個分離菌株均為酵母菌。近年來，關于酵母菌生物活性的報道越來越多。Pichia kudriavzeviiOT38接入土壤15 d以后提高了土壤生物炭、脫氫酶活性以及膠體多糖等含量，可以作為土壤改良劑利用[32]。Kluyveromyces marxianusHP-10菌株懸浮液通過營養(yǎng)和空間的競爭以及誘導抗病性相關酶的活性，較好地抑制了柑橘采后綠霉病菌，保證了果實的品質(zhì)[33]。采后用Meyerozyma guilliermondiiSQUCC-33Y處理草莓果實可以顯著降低由Alternaria alternata引起的果實腐爛病斑，該拮抗酵母菌可作為一種生物殺菌劑用于防治A.alternata引起的草莓采后果實腐爛病[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌的次生代謝物生物活性廣泛，但目前尚未見其在除草方面的報道。本研究首次報道酵母菌發(fā)酵液具有優(yōu)異除草潛力，今后可加深對菌株16-8的研究，分析其代謝產(chǎn)物中具有除草潛力的活性成分。本研究拓展了具有除草潛力的微生物資源，為微生物除草劑的開發(fā)利用提供菌株資源。