蒙思妤，鄧業(yè)成，廖金梅，韋堅(jiān)芬，鄧志勇，駱海玉

（珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006）

0 引言

【研究意義】草珊瑚[Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai]是傳統(tǒng)的中草藥，隸屬于金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物[1]，因其成熟果實(shí)與紅色珊瑚相似而得此名，又名腫節(jié)風(fēng)和九節(jié)茶[2]。草珊瑚具有重要的藥用價(jià)值，全株可入藥，味苦、辛，性平，可用于治療創(chuàng)傷性骨折、喉痛、關(guān)節(jié)腫脹和膿腫等癥狀[3]，同時(shí)還具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤等生物活性。我國(guó)民間還出現(xiàn)了許多具有顯著效果的含草珊瑚處方，其中苗醫(yī)利用草珊瑚治療創(chuàng)傷性骨折的處方已經(jīng)被列入國(guó)家非物質(zhì)文化遺傳保護(hù)名錄[4]。草珊瑚植株具有較強(qiáng)的抗菌活性，探尋對(duì)植物和動(dòng)物致病菌抑制效果顯著的拮抗菌株，研發(fā)高效無(wú)害的廣譜殺菌劑，對(duì)控制植物病害的危害具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】經(jīng)現(xiàn)代化學(xué)分析技術(shù)研究，草珊瑚提取物主要含有萜類、黃酮類、香豆素、酚酸類、揮發(fā)油等成分[5-7]。在有關(guān)草珊瑚化學(xué)成分的研究中，多認(rèn)為其黃酮類成分的含量與植株的質(zhì)量是成正比的，即黃酮類成分含量越高，其價(jià)值就越高[8]，而在《中國(guó)藥典》中則以香豆素中的異嗪皮啶含量為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[9]。在抗菌活性方面，邵佳[10]發(fā)現(xiàn)草珊瑚總黃酮對(duì)大腸桿菌的抑制率為47.03%。郭蒙蒙[11]使用草珊瑚提取物對(duì)耐藥幽門螺桿菌菌株開(kāi)展了抑菌研究，于體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其對(duì)耐藥幽門螺旋桿菌有明顯的抑制效果，MIC 介于 11.9～47.5 μg·mL-1，與阿莫西林等常見(jiàn)抗生素聯(lián)合抗菌表現(xiàn)出協(xié)同作用，其作用機(jī)制可能與破壞幽門螺桿菌的外膜屏障功能有關(guān)。郁建生等[12]在治療禽類細(xì)菌感染性疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)，草珊瑚口服液和注射液對(duì)禽霍亂等動(dòng)物病害具有良好的治療效果。此外，宋利沙等[13]在測(cè)定草珊瑚內(nèi)生真菌（橡膠生擬莖點(diǎn)霉菌和新殼梭孢菌）的抑菌活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)三七灰霉病菌等7種病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率均達(dá)80%以上。【本研究切入點(diǎn)】植物內(nèi)生真菌不僅能為寄主植物提供營(yíng)養(yǎng)，為寄主植物提高抗生物和非生物逆境能力，還能與寄主植物協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)生具有不同生物活性的次生代謝物[14-15]。同時(shí)，植物內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)相比較于植物的生長(zhǎng)繁殖具有不受自然環(huán)境的限制、生長(zhǎng)成本低、可控性強(qiáng)以及產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。近幾年對(duì)于草珊瑚的研究大多集中在其化學(xué)成分、臨床應(yīng)用和藥理研究等方向，相對(duì)其內(nèi)生真菌的生物活性方面的研究報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】擬從草珊瑚內(nèi)生真菌中分離篩選出具有抗菌活性的菌種，旨在從活性菌株中進(jìn)一步分離得到具有高效抑菌活性的單體化合物，有效推動(dòng)草珊瑚資源的利用與發(fā)展，進(jìn)一步為防治植物病害生物領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試內(nèi)生真菌 擬可可毛球二孢菌（Lasiodiplodia pseudotheobromae），由本實(shí)驗(yàn)室分離。

1.1.2 供試植物病原真菌 供試植物病原真菌如表1所示。

1.1.3 供試病原細(xì)菌 供試病原細(xì)菌如表2所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗真菌活性 首先對(duì)各菌株進(jìn)行活化，接著將孔徑0.4 cm的菌餅接入PDB培養(yǎng)基中（1菌餅/100 mLPDB），置于恒溫箱中（27 ℃ ) 靜置培養(yǎng)45 d，得到發(fā)酵種子液。后使用張澤等[16]的方法，得到乙酸乙酯萃取浸膏、正丁醇萃取浸膏和萃余層浸膏。再將所得濾渣使用甲醇浸泡72 h，m（濾渣）∶V（甲醇）＝1∶3，提取3次，使用超聲波清洗儀提取30 min，重復(fù)抽濾3次去渣留液，濃縮蒸干濾液，即得到菌絲體甲醇萃取浸膏。

參考Deng等[17]的菌絲生長(zhǎng)速率法，將羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌作為指示菌株，對(duì)7株草珊瑚內(nèi)生菌株進(jìn)行篩選。在超凈工作臺(tái)中將活性菌株各個(gè)萃取層的浸膏用丙酮溶解，并稀釋成質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的藥液，待用。溶解PDA培養(yǎng)基呈液狀，待其降至50～60℃，將1 mL藥液與9 mL培養(yǎng)基混合，搖晃均勻，配置成含藥2 mg·mL-1的帶藥平板。將直徑為0.4 cm的菌餅菌絲面朝下接種于帶藥平板上（3個(gè)菌餅/1個(gè)培養(yǎng)基），使3個(gè)菌餅在平板中心并呈一個(gè)邊長(zhǎng)為3 cm的等邊三角形排列。將指示菌株接于PDA平板中點(diǎn)作為對(duì)照組。于（27±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，運(yùn)用十字交叉法測(cè)量菌株菌落的長(zhǎng)短直徑（計(jì)量單位統(tǒng)一為cm），根據(jù)下列公式計(jì)算抑菌率。

式中，D0為對(duì)照組菌落直徑，D1為處理組菌落直徑。

1.2.2 7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗細(xì)菌活性測(cè)定參考陸春雷等[18]、潘立衛(wèi)等[19]的最低抑制濃度法并稍加修改測(cè)定7株內(nèi)生真菌萃取物（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、菌絲體甲醇萃取物）對(duì)3種病原細(xì)菌的抗菌活性。將供試細(xì)菌置于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基搖床發(fā)酵12 h，后用無(wú)菌水稀釋10倍，待用。樣品用V（丙酮）∶V（水）＝1∶1配成一系列濃度梯度。取8支試管，分別編號(hào)1-8號(hào)。1-6號(hào)試管：由高到低依次加入上述濃度梯度的0.1 mL樣品藥液、0.1 mL病原細(xì)菌稀釋液和0.8 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基；7號(hào)試管：加等量稀釋菌液和培養(yǎng)基，不加藥液，作為陽(yáng)性對(duì)照；8號(hào)試管：加入 0.1 mLV（丙酮）∶V（水）＝1∶1和等量培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，若試管澄清透明，搖勻后仍然澄清，認(rèn)為該試管無(wú)菌生長(zhǎng)，若試管呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明該試管有菌生長(zhǎng)。以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC[20]。

1.2.3 內(nèi)生真菌 J-10 發(fā)酵培養(yǎng) 活化 J-10 后，其發(fā)酵產(chǎn)物處理同 1.2.1。

1.2.4 內(nèi)生真菌 J-10對(duì) 7 種植物病原真菌毒力 采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定內(nèi)生菌株J-10的 3 種萃取物（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、 菌絲體甲醇萃取物）對(duì) 7 種供試植物病原真菌的抑菌活性。方法同 1.2.1，配置一定濃度梯度帶藥培養(yǎng)基。通過(guò)SPSS19.0 軟件統(tǒng)計(jì)抑制率，再按照武懷恒等[21]的方法計(jì)算得到毒力回歸方程。

1.2.5 內(nèi)生真菌 J-10對(duì)11種致病細(xì)菌的最低抑制濃度 采用最低抑制濃度法，測(cè)定內(nèi)生菌株J-10的 3種萃取物（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、 菌絲體甲醇萃取物）對(duì) 11種供試致病細(xì)菌的抑菌活性，試驗(yàn)方法同1.2.2。

1.2.6 活性菌株的鑒定 選取抑菌效果最為顯著的內(nèi)生真菌J-10，觀察其菌落形態(tài)，驗(yàn)證其生物學(xué)特征并結(jié)合光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。再委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行ITS測(cè)序分析,將所獲序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗真菌活性

以羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌為指示菌株，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性。圖1為7株內(nèi)生真菌菌落形態(tài)圖，圖2為7株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)兩種指示菌株的菌斑圖（抑菌率＞50%）。7種內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌的抑制結(jié)果（表3）顯示，J-10甲醇萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)兩種指示菌株的抑制效果最強(qiáng)，抑制率介于84.84%～88.51%；G-5甲醇萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)甘蔗鳳梨病菌的抑菌率達(dá)86.23%和92.75%，其正丁醇萃取物對(duì)羅漢果根腐病的抑制率為73.53%；J-12乙酸乙酯萃取物對(duì)甘蔗鳳梨病菌的抑制率為73.9%，但是其余萃取層對(duì)兩種指示菌的抑制效果不佳甚至無(wú)活性。

表3 7種內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌的抑制效果Table 3 Antimicrobial activity of fermentation products of 7 endophytic fungi against C.paradoxa and F.solani

圖1 7種草珊瑚內(nèi)生真菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphologies of 7 endophytic fungi

圖2 7株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌抑制活性菌斑圖（抑菌率＞50 %）Fig.2 Antimicrobial activity of secondary metabolites of 7 endophytic fungi against C.paradoxa and F.solani (bacteriostatic rate＞50%)

2.2 7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗細(xì)菌活性

以溶壁微球菌（G+）、普通變形桿菌（G-）和羅漢果青枯菌（G-）作為指示菌株，采用最低抑制濃度法測(cè)定J-9、J-10、J-12、J-20、G-4、G-5、Y-8等7株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗細(xì)菌活性，結(jié)果見(jiàn)表4。菌株J-10的甲醇提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)3種指示菌株均有較強(qiáng)的抑制活性，其MIC值均＜0.6 mg·mL-1。7種活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的甲醇和乙酸乙酯提取物對(duì)3種活性菌株的抑制活性相當(dāng)，都具有一定抑制活性；除菌株J-9和J-10外，其余菌株的正丁醇提取物對(duì)3種指示菌株的抑制活性較低甚至無(wú)活性。

表4 7種內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)3種致病細(xì)菌的抑制作用Table 4 Antimicrobial activities of 7 endophytic fungi fermentation products against 3 pathogens

綜合7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)2種植物病原真菌和3種致病細(xì)菌的試驗(yàn)結(jié)果，選擇J-10菌株進(jìn)一步測(cè)定其抑菌活性，以期篩選出具有廣譜抑菌性且抑菌效果顯著的菌株。

2.3 內(nèi)生真菌J-10發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)植物病原真菌的毒力

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)菌株J-10發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了J-10發(fā)酵產(chǎn)物的2種不同溶劑萃取物對(duì)7種常見(jiàn)植物致病真菌的毒力，結(jié)果如表5、圖3所示。結(jié)果顯示，J-10的乙酸乙酯萃取物對(duì)7種供試植物致病真菌的毒力最為顯著，EC50介于0.199 5～1.172 2 mg·mL-1，其中，對(duì)玉米大斑病菌的毒力最強(qiáng)，對(duì)羅漢果根腐病菌的毒力最弱。J-10菌絲體甲醇提取物對(duì)7種致病真菌的EC50介于0.125 5～9.468 7 mg·mL-1，其中，對(duì)茶輪斑病菌的毒力最強(qiáng)，對(duì)羅漢果根腐病的毒力最弱。

圖3 J-10發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取層對(duì)7種植物病原真菌的抑制活性（菌斑圖）Fig.3 Antimicrobial activities of J-10 extracts against 7 plant pathogens (plaque diagram)

表5 J-10發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑層對(duì)7種植物病原菌的抑制活性Table 5 Antimicrobial activities of J-10 extracts against 7 plant pathogens

2.4 內(nèi)生真菌J-10發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)11種致病細(xì)菌的最低抑制濃度

采用最低抑制濃度法測(cè)定內(nèi)生真菌J-10的乙酸乙酯、正丁醇和菌絲體甲醇萃取物對(duì)11種常見(jiàn)致病細(xì)菌的 MIC 值。結(jié)果（表6）顯示內(nèi)生真菌J-10正丁醇和菌絲體甲醇萃取物對(duì)11種供試細(xì)菌的MIC介于0.125 0～5.000 0 mg·mL-1，其中，對(duì)普通變形桿菌和大腸桿菌的抑菌效果最好。其乙酸乙酯萃取物對(duì)11種供試細(xì)菌的MIC介于0.125 0～2.500 0 mg·mL-1，其中對(duì)普通變形桿菌、大腸桿菌、羅漢果青枯菌和溶壁微球菌的抑菌效果最好，均＞5.000 0 mg·mL-1，其中對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果最好。此外，3種不同溶劑提取物對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽(yáng)性菌。

表6 J-10發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑層對(duì)11種致病細(xì)菌的抑制活性Table 6 Antimicrobial effects of J-10 extracts against 11 pathogens

2.5 活性內(nèi)生真菌的鑒定

將菌株J-10送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，基于測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)分析，最終確定J-10為擬可可毛球二孢菌。

圖4 菌株J-10的18srDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 18S rDNA of J-10

2.6 內(nèi)生真菌J-10菌落特征

圖5為擬可可毛色二孢菌菌落形態(tài)，其菌落在PDA平板培養(yǎng)基上最初呈白色圓形，菌絲蓬松，生長(zhǎng)速度快。在27 ℃的自然光條件下，24 h后測(cè)量菌落直徑為49 mm，38 h后可長(zhǎng)滿培養(yǎng)基（d=90 mm）。大約5 d后表面顏色變?yōu)闇\灰白色，培養(yǎng)基背面顏色變?yōu)闇\灰色至灰色，圓心有一圈灰褐色菌絲，20 d后整個(gè)培養(yǎng)基呈現(xiàn)灰褐色絨狀，培養(yǎng)基背面為黑褐色，后正背面均變?yōu)樘亢谏?/p>

圖5 擬可可毛球二孢菌菌落生長(zhǎng)形態(tài)Fig.5 Cultured L.pseudotheobromae colonies

3 討論

本研究探討了7種草珊瑚內(nèi)生真菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)G-5乙酸乙酯萃取物對(duì)甘蔗鳳梨病菌的抑制活性最強(qiáng)，但是擬可可毛球二孢菌發(fā)酵產(chǎn)物甲醇和乙酸乙酯萃取物對(duì)菌株的抑制作用更為廣泛，且抑制效果顯著 。草珊瑚內(nèi)生真菌擬可可毛球二孢菌對(duì)辣椒炭疽病菌、茶輪斑病菌、甘藍(lán)黑斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、玉米大斑病菌、貢柑鏈格孢菌和羅漢果根腐病菌等7種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用；對(duì)普通變形桿菌、傷寒沙門氏菌、羅漢果青枯菌、大腸桿菌、溶壁微球菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽桿菌、藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌等11種致病細(xì)菌具有一定的抗菌活性。目前，草珊瑚及其亞種海南草珊瑚在我國(guó)分布較廣泛，童悅[22]對(duì)二者粗提物對(duì)芒果膠孢炭疽菌抑菌效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明后者對(duì)芒果膠孢炭疽菌的活性遠(yuǎn)高于前者，前者EC50為15.85 mg·mL-1，后者EC50為1.46 mg·mL-1。張焱珍等[23]測(cè)定了77種植物提取物對(duì)12種較為常見(jiàn)的植物病原真菌的抑制活性，其中，海南草珊瑚0.2 mg·mL-1粗提物對(duì)玉米大斑病菌無(wú)抑菌活性。本研究在草珊瑚中分離得到擬可可毛球二孢菌，而其發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯層萃取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，其中，對(duì)玉米大斑病菌的EC50為0.199 5 mg·mL-1。另外，其不同溶劑萃取層對(duì)11種致病細(xì)菌MIC值介于0.125～5.000 mg·mL-1，與前人[24-27]的研究相比，擬可可毛球二孢菌的抑菌效果相對(duì)較強(qiáng)。此外，該菌甲醇萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)玉米大斑病菌、茶輪斑病菌和貢柑鏈格孢菌的抑菌活性以及該菌乙酸乙酯萃取物對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌活性均低于多菌靈[28]（98%原液，MIC分別為 8.765 9、7.226 9、1.422 4、1.372 9 mg·mL-1）。目前關(guān)于草珊瑚的研究仍然集中在探索其提取物的活性上，該植株的藥理作用與化學(xué)成分之間的相關(guān)性尚未明確，值得進(jìn)一步展開(kāi)研究。

擬可可毛色二孢菌是一種生長(zhǎng)繁殖快速、生物量較大的一種真菌，不僅能抑制上述供試致病菌的生長(zhǎng)，同時(shí)也是一種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上危害極其嚴(yán)重的病原菌，廣泛寄生在熱帶、亞熱帶地區(qū)一些果樹(shù)和楠木[29]上，危害植物的枝干和果實(shí)，引起潰瘍病[30]等病癥，可致使果樹(shù)枝葉及其果實(shí)腐爛。擬可可毛色二孢菌雖是一種植物致病菌，但本研究發(fā)現(xiàn)其次生代謝物中可能含有與抑菌有關(guān)的物質(zhì)，大部分在乙酸乙酯萃取層，為尋找活性成分縮小了一定范圍，為生物源抗菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。