安明珠 朱文露 彭亞萍 韓 博 周 凱

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201

鴨茅（Dactylis glomerataL.），又名果園草（Orchardgrass）或雞腳草（Cocksfoot），是禾本科（Poaccae）鴨茅屬（Dactylis）的唯一物種[1]。鴨茅的耐陰性較強(qiáng)、葉產(chǎn)量高[2]，是畜牧業(yè)發(fā)展和改良環(huán)境的重要牧草草種之一，在青貯飼料的制備[3]、草地恢復(fù)[4]等方面廣泛應(yīng)用。

野生鴨茅的種質(zhì)資源豐富，遺傳多樣性較高，是進(jìn)行育種及物種保護(hù)的重要基因材料來源[2]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于鴨茅的起源及進(jìn)化的研究集中于地理學(xué)數(shù)據(jù)和形態(tài)學(xué)標(biāo)記[5]、分子標(biāo)記[6]以及葉綠體和ITS 序列[7]數(shù)據(jù)之上。隨著鴨茅生存環(huán)境的變化，形態(tài)學(xué)分類和分子標(biāo)記技術(shù)受外界影響較大，對(duì)物種分類會(huì)造成一定的誤差[8]。單拷貝核基因?qū)儆谥毕低椿?，繼承雙親的遺傳信息，沒有核苷酸偏向性和內(nèi)部重復(fù)，攜帶大量的信息位點(diǎn)，進(jìn)化速率中等，更適合用于對(duì)物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[9]。武潑潑等[10]基于單拷貝核基因DMC1 基因序列對(duì)中國(guó)短柄草種族進(jìn)行分類研究，為其系統(tǒng)進(jìn)化提供可靠證據(jù)。胡曉艷等[11]利用單拷貝核基因?qū)λ釛椀倪z傳多樣性進(jìn)行研究，證明單拷貝適用于物種遺傳多樣性應(yīng)用，這為后續(xù)的酸棗種質(zhì)資源保護(hù)及利用奠定了基礎(chǔ)。劉舒宇等[12]通過設(shè)計(jì)并篩選出楊柳科單拷貝核基因DSH引物，并對(duì)4 個(gè)屬的代表物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，為進(jìn)一步深入了解楊柳科植物的遺傳多樣性提供數(shù)據(jù)支撐。Joly 等[13]開發(fā)了單拷貝核基因GAPDH作為核基因標(biāo)記，重構(gòu)了北美薔薇屬植物的多倍體起源。李爽等[14]基于單拷貝核基因PAL檢測(cè)到貴州金花茶具有低水平的遺傳多樣性和中等水平的遺傳分化，從而為最大程度保護(hù)貴州金花茶的遺傳多樣性奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。RPB1基因?qū)儆趩慰截惡嘶?，是RNA 聚合酶Ⅱ上最重要的大亞基，其拷貝數(shù)較低，廣泛應(yīng)用于群體遺傳進(jìn)化研究中，以揭示居群遺傳多樣性和遺傳分化[14-16]。

目前，在鴨茅的系統(tǒng)發(fā)育分析上，單拷貝核基因RPB1還未曾應(yīng)用，因此本研究通過設(shè)計(jì)鴨茅單拷貝核基因RPB1的引物，并對(duì)篩選后的引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，從而用于后續(xù)進(jìn)一步探索鴨茅不同亞種間的親緣關(guān)系，此結(jié)果對(duì)鴨茅的起源進(jìn)化和資源保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料為種植于云南省曲靖市馬龍區(qū)馬鳴市鴨茅圃的鴨茅亞種D.glomeratasubsp.woronowii和D.glomerata subsp.hispanica。在2020 年7 月收集鴨茅新鮮葉片，使用變色硅膠進(jìn)行干燥保存，用于植物DNA 提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1）植物DNA 的提取。使用北京天根生物科技有限公司提供的Ezup 柱式植物基因DNA 提取試劑盒提取鴨茅葉片DNA，具體方法參考其說明書。稱取30～50 mg 鴨茅葉片，加入液氮快速研磨至粉末，然后通過試劑盒中的藥品進(jìn)行溶解并提取，最終得到鴨茅DNA。提取后的DNA 樣用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的樣品放置-20 ℃冰箱中進(jìn)行保存。

2）引物設(shè)計(jì)。鴨茅RPB1 基因序列由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)張新全教授提供，利用Beacon Designer v.8 和Primer Blast 軟件設(shè)計(jì)鴨茅單拷貝核基因RPB1 引物序列，記錄其引物名稱、堿基序列、引物長(zhǎng)度、退火溫度（表1）。將引物送到公司進(jìn)行合成干粉，并按照要求將濃度稀釋為100 μmol/L。

表1 引物序列

3）PCR 擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠檢測(cè)。通過PCR 擴(kuò)增技術(shù)，將退火溫度設(shè)置為12 個(gè)梯度，具體溫度以記錄的溫度為標(biāo)線，上下調(diào)整10 ℃作為引物退火溫度區(qū)間。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：2.5μL DNA 樣（10 ng/μL），2.5 μL 上游引物（10 μmol/L），2.5 μL下游引物（10 μmol/L），25 μL Mix Taq PCR Master（1x），用去離子水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃3 min，94 ℃30 s，Tm 30 s，72 ℃1 min，35 X，72 ℃8 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外燈下進(jìn)行觀察，根據(jù)條帶的清晰程度以及特異性與否，篩選出最適的引物對(duì)及退火溫度，用于后續(xù)試驗(yàn)。

4）測(cè)序。將符合要求的PCR 產(chǎn)物送到上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，然后通過chromas 查看峰圖，并在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast 進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及退火溫度的篩選

通過對(duì)10 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并設(shè)置12 個(gè)退火溫度梯度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)RPB1（3F，3R）、RPB1（4F，4R）2 對(duì)引物能夠擴(kuò)增出明亮的1 條帶且在58 ℃時(shí)最為明顯，說明這2 對(duì)引物設(shè)計(jì)合理，特異性較強(qiáng)。

2.2 引物序列峰圖分析

將得到的引物序列通過chromas 軟件后，每個(gè)序列得到1 個(gè)峰圖。通過峰重疊情況來判斷此引物序列是否能用于鴨茅系統(tǒng)發(fā)育分析。正常峰的峰圖序列連續(xù)，且無重疊峰和無poly 結(jié)構(gòu)，峰圖結(jié)構(gòu)明顯清晰，為合適的引物序列；重疊峰的峰圖中有大量的重疊，說明在測(cè)序反應(yīng)之后產(chǎn)生了不止1 條序列，則說明該引物設(shè)計(jì)不合格；poly 結(jié)構(gòu)峰圖為出現(xiàn)連續(xù)單個(gè)堿基重復(fù)，會(huì)造成重疊峰，甚至造成反應(yīng)中斷，測(cè)序失敗，不是合適的引物序列。如圖2 所示，所選引物的峰圖均為正常峰，無重疊峰。

2.3 測(cè)序及驗(yàn)證

在NCBI 庫(kù)中輸入獲得的序列信息進(jìn)行Blast 比對(duì)（圖3），2 對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物均為目的基因片段。

3 討 論

鴨茅物種及亞種間明確的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，是鴨茅種質(zhì)資源更好地保存和利用的依據(jù)，是現(xiàn)代牧草品種選育和改良的必要理論基礎(chǔ)之一。不同倍性的鴨茅亞種同域共生，形態(tài)上較為相似，隨著環(huán)境的變化，鴨茅的形態(tài)也隨之發(fā)生改變，這導(dǎo)致對(duì)鴨茅進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類存在一定的誤差[17-19]。分子標(biāo)記技術(shù)從一定程度上避免了這種誤差，但由于分子標(biāo)記技術(shù)的費(fèi)用較貴且耗時(shí)長(zhǎng)，所以在物種的遺傳多樣性研究中未普遍應(yīng)用[20-21]，基于葉綠體基因建立系統(tǒng)發(fā)育樹的分析報(bào)道較少[22]，而對(duì)于從核基因方面進(jìn)行鴨茅系統(tǒng)發(fā)育分析未見相關(guān)報(bào)道。

鴨茅的分類階元較低，需要一些進(jìn)化速率較快且變異位點(diǎn)較多的基因來研究鴨茅的系統(tǒng)發(fā)育問題。核基因的進(jìn)化速率快于葉綠體基因和線粒體基因，基因序列在進(jìn)化過程存在豐富的變異位點(diǎn)，為研究種間或?qū)匍g系統(tǒng)發(fā)育分析提供可用的變異信息[23]。RPB1 屬于單拷貝核基因，廣泛應(yīng)用于群體遺傳進(jìn)化研究中[14-16]。燕薇等[24]利用RPB1 基因?qū)λ{(lán)葉蟲微孢子蟲進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析研究，進(jìn)一步證實(shí)了親緣關(guān)系分類。李銀雙等[25]利用RPB1 對(duì)羊肚菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，為其準(zhǔn)確分類提供了科學(xué)分類。

本試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)單拷貝核基因RPB1 引物，優(yōu)化其退火溫度，這為后續(xù)研究鴨茅不同亞種之間的起源和親緣關(guān)系奠定基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)的10 對(duì)鴨茅單拷貝核基因RPB1 引物，篩選出2 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一且擴(kuò)增效果較好的引物，通過溫度梯度PCR 篩選了退火溫度為58 ℃，通過測(cè)序和Blast 比對(duì)驗(yàn)證了其對(duì)應(yīng)的目的基因。