安明珠 朱文露 彭亞萍 韓 博 周 凱
云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201
鴨茅(Dactylis glomerataL.),又名果園草(Orchardgrass)或雞腳草(Cocksfoot),是禾本科(Poaccae)鴨茅屬(Dactylis)的唯一物種[1]。鴨茅的耐陰性較強(qiáng)、葉產(chǎn)量高[2],是畜牧業(yè)發(fā)展和改良環(huán)境的重要牧草草種之一,在青貯飼料的制備[3]、草地恢復(fù)[4]等方面廣泛應(yīng)用。
野生鴨茅的種質(zhì)資源豐富,遺傳多樣性較高,是進(jìn)行育種及物種保護(hù)的重要基因材料來(lái)源[2]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于鴨茅的起源及進(jìn)化的研究集中于地理學(xué)數(shù)據(jù)和形態(tài)學(xué)標(biāo)記[5]、分子標(biāo)記[6]以及葉綠體和ITS 序列[7]數(shù)據(jù)之上。隨著鴨茅生存環(huán)境的變化,形態(tài)學(xué)分類和分子標(biāo)記技術(shù)受外界影響較大,對(duì)物種分類會(huì)造成一定的誤差[8]。單拷貝核基因?qū)儆谥毕低椿?,繼承雙親的遺傳信息,沒(méi)有核苷酸偏向性和內(nèi)部重復(fù),攜帶大量的信息位點(diǎn),進(jìn)化速率中等,更適合用于對(duì)物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[9]。武潑潑等[10]基于單拷貝核基因DMC1 基因序列對(duì)中國(guó)短柄草種族進(jìn)行分類研究,為其系統(tǒng)進(jìn)化提供可靠證據(jù)。胡曉艷等[11]利用單拷貝核基因?qū)λ釛椀倪z傳多樣性進(jìn)行研究,證明單拷貝適用于物種遺傳多樣性應(yīng)用,這為后續(xù)的酸棗種質(zhì)資源保護(hù)及利用奠定了基礎(chǔ)。劉舒宇等[12]通過(guò)設(shè)計(jì)并篩選出楊柳科單拷貝核基因DSH引物,并對(duì)4 個(gè)屬的代表物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,為進(jìn)一步深入了解楊柳科植物的遺傳多樣性提供數(shù)據(jù)支撐。Joly 等[13]開發(fā)了單拷貝核基因GAPDH作為核基因標(biāo)記,重構(gòu)了北美薔薇屬植物的多倍體起源。李爽等[14]基于單拷貝核基因PAL檢測(cè)到貴州金花茶具有低水平的遺傳多樣性和中等水平的遺傳分化,從而為最大程度保護(hù)貴州金花茶的遺傳多樣性奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。RPB1基因?qū)儆趩慰截惡嘶?,是RNA 聚合酶Ⅱ上最重要的大亞基,其拷貝數(shù)較低,廣泛應(yīng)用于群體遺傳進(jìn)化研究中,以揭示居群遺傳多樣性和遺傳分化[14-16]。
目前,在鴨茅的系統(tǒng)發(fā)育分析上,單拷貝核基因RPB1還未曾應(yīng)用,因此本研究通過(guò)設(shè)計(jì)鴨茅單拷貝核基因RPB1的引物,并對(duì)篩選后的引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,從而用于后續(xù)進(jìn)一步探索鴨茅不同亞種間的親緣關(guān)系,此結(jié)果對(duì)鴨茅的起源進(jìn)化和資源保護(hù)具有重要意義。
試驗(yàn)材料為種植于云南省曲靖市馬龍區(qū)馬鳴市鴨茅圃的鴨茅亞種D.glomeratasubsp.woronowii和D.glomerata subsp.hispanica。在2020 年7 月收集鴨茅新鮮葉片,使用變色硅膠進(jìn)行干燥保存,用于植物DNA 提取。
1)植物DNA 的提取。使用北京天根生物科技有限公司提供的Ezup 柱式植物基因DNA 提取試劑盒提取鴨茅葉片DNA,具體方法參考其說(shuō)明書。稱取30~50 mg 鴨茅葉片,加入液氮快速研磨至粉末,然后通過(guò)試劑盒中的藥品進(jìn)行溶解并提取,最終得到鴨茅DNA。提取后的DNA 樣用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)合格的樣品放置-20 ℃冰箱中進(jìn)行保存。
2)引物設(shè)計(jì)。鴨茅RPB1 基因序列由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)張新全教授提供,利用Beacon Designer v.8 和Primer Blast 軟件設(shè)計(jì)鴨茅單拷貝核基因RPB1 引物序列,記錄其引物名稱、堿基序列、引物長(zhǎng)度、退火溫度(表1)。將引物送到公司進(jìn)行合成干粉,并按照要求將濃度稀釋為100 μmol/L。
表1 引物序列
3)PCR 擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠檢測(cè)。通過(guò)PCR 擴(kuò)增技術(shù),將退火溫度設(shè)置為12 個(gè)梯度,具體溫度以記錄的溫度為標(biāo)線,上下調(diào)整10 ℃作為引物退火溫度區(qū)間。PCR 反應(yīng)體系(50 μL):2.5μL DNA 樣(10 ng/μL),2.5 μL 上游引物(10 μmol/L),2.5 μL下游引物(10 μmol/L),25 μL Mix Taq PCR Master(1x),用去離子水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃3 min,94 ℃30 s,Tm 30 s,72 ℃1 min,35 X,72 ℃8 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在紫外燈下進(jìn)行觀察,根據(jù)條帶的清晰程度以及特異性與否,篩選出最適的引物對(duì)及退火溫度,用于后續(xù)試驗(yàn)。
4)測(cè)序。將符合要求的PCR 產(chǎn)物送到上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序,然后通過(guò)chromas 查看峰圖,并在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast 進(jìn)行序列比對(duì)。
通過(guò)對(duì)10 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,并設(shè)置12 個(gè)退火溫度梯度,發(fā)現(xiàn)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)RPB1(3F,3R)、RPB1(4F,4R)2 對(duì)引物能夠擴(kuò)增出明亮的1 條帶且在58 ℃時(shí)最為明顯,說(shuō)明這2 對(duì)引物設(shè)計(jì)合理,特異性較強(qiáng)。
將得到的引物序列通過(guò)chromas 軟件后,每個(gè)序列得到1 個(gè)峰圖。通過(guò)峰重疊情況來(lái)判斷此引物序列是否能用于鴨茅系統(tǒng)發(fā)育分析。正常峰的峰圖序列連續(xù),且無(wú)重疊峰和無(wú)poly 結(jié)構(gòu),峰圖結(jié)構(gòu)明顯清晰,為合適的引物序列;重疊峰的峰圖中有大量的重疊,說(shuō)明在測(cè)序反應(yīng)之后產(chǎn)生了不止1 條序列,則說(shuō)明該引物設(shè)計(jì)不合格;poly 結(jié)構(gòu)峰圖為出現(xiàn)連續(xù)單個(gè)堿基重復(fù),會(huì)造成重疊峰,甚至造成反應(yīng)中斷,測(cè)序失敗,不是合適的引物序列。如圖2 所示,所選引物的峰圖均為正常峰,無(wú)重疊峰。
在NCBI 庫(kù)中輸入獲得的序列信息進(jìn)行Blast 比對(duì)(圖3),2 對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物均為目的基因片段。
鴨茅物種及亞種間明確的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,是鴨茅種質(zhì)資源更好地保存和利用的依據(jù),是現(xiàn)代牧草品種選育和改良的必要理論基礎(chǔ)之一。不同倍性的鴨茅亞種同域共生,形態(tài)上較為相似,隨著環(huán)境的變化,鴨茅的形態(tài)也隨之發(fā)生改變,這導(dǎo)致對(duì)鴨茅進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類存在一定的誤差[17-19]。分子標(biāo)記技術(shù)從一定程度上避免了這種誤差,但由于分子標(biāo)記技術(shù)的費(fèi)用較貴且耗時(shí)長(zhǎng),所以在物種的遺傳多樣性研究中未普遍應(yīng)用[20-21],基于葉綠體基因建立系統(tǒng)發(fā)育樹的分析報(bào)道較少[22],而對(duì)于從核基因方面進(jìn)行鴨茅系統(tǒng)發(fā)育分析未見相關(guān)報(bào)道。
鴨茅的分類階元較低,需要一些進(jìn)化速率較快且變異位點(diǎn)較多的基因來(lái)研究鴨茅的系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題。核基因的進(jìn)化速率快于葉綠體基因和線粒體基因,基因序列在進(jìn)化過(guò)程存在豐富的變異位點(diǎn),為研究種間或?qū)匍g系統(tǒng)發(fā)育分析提供可用的變異信息[23]。RPB1 屬于單拷貝核基因,廣泛應(yīng)用于群體遺傳進(jìn)化研究中[14-16]。燕薇等[24]利用RPB1 基因?qū)λ{(lán)葉蟲微孢子蟲進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析研究,進(jìn)一步證實(shí)了親緣關(guān)系分類。李銀雙等[25]利用RPB1 對(duì)羊肚菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,為其準(zhǔn)確分類提供了科學(xué)分類。
本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)單拷貝核基因RPB1 引物,優(yōu)化其退火溫度,這為后續(xù)研究鴨茅不同亞種之間的起源和親緣關(guān)系奠定基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)的10 對(duì)鴨茅單拷貝核基因RPB1 引物,篩選出2 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一且擴(kuò)增效果較好的引物,通過(guò)溫度梯度PCR 篩選了退火溫度為58 ℃,通過(guò)測(cè)序和Blast 比對(duì)驗(yàn)證了其對(duì)應(yīng)的目的基因。