關(guān)文怡 譚 晨 王喜順

1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，北京 102442；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；3.北京市延慶區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，北京 102100

隨著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，家禽個體間密切接觸，病原廣泛分布，使得禽病表現(xiàn)出疾病種類多、群發(fā)性強、并發(fā)癥多、繼發(fā)感染復雜的特點，僅依靠流行病學、臨床癥狀、病理剖檢等方法已不能作出準確的診斷，實驗室檢驗已成為準確診斷禽病的重要依據(jù)。血液樣品的采集、制備與保存是實驗室檢驗工作的重要準備，是保證準確診斷的基本條件。因此，家禽血液樣本的采集技術(shù)、制備方法、保存條件及準確應(yīng)用是禽病實驗室診斷和禽病監(jiān)測的核心技術(shù)，是獸醫(yī)及時作出診斷結(jié)論、評估禽群免疫抗體水平、掌握疾病與疫情動態(tài)的科學依據(jù)。

1 禽病的實驗室診斷

常見禽病主要有禽傳染病、禽寄生蟲病和禽常見代謝與中毒病。在禽病日常診斷中，大多通過流行病學診斷、臨床檢查、病理剖檢診斷可對一般禽病作出初診，但當禽病未出現(xiàn)典型癥狀和病理變化時或需要作出確診時，就需要借助實驗室方法進行診斷。禽病的實驗室診斷包括病原學診斷和血清學診斷2 種方法[1]。

1.1 病原學診斷

禽病的病原學診斷包括禽病的細菌學檢驗、禽病的病毒學檢驗和禽寄生蟲病檢驗3 部分。細菌學檢驗的主要方法有細菌的涂片、染色、鏡檢，細菌的生化特性鑒定和藥敏試驗等。病毒學檢驗主要是通過動物接種、雞胚培養(yǎng)和組織細胞培養(yǎng)進行病毒的分離培養(yǎng)及通過電鏡檢查、補體結(jié)合試驗、沉淀反應(yīng)、熒光抗體和酶標抗體檢測等方法進行病毒的鑒定。禽寄生蟲病檢驗主要是用涂片法、沉淀法、漂浮法進行的蟲卵檢查和分離法、培養(yǎng)法、染色法進行的蟲體檢查等方法。

1.2 血清學診斷

血清學診斷是利用免疫學中抗原抗體反應(yīng)為基本原理的一類用于細菌、病毒、寄生蟲的分類、鑒定及抗原分析等方面的診斷技術(shù)。用已知的抗體對分離獲得的病原體進行鑒定，也可用已知的抗原對已康復的或隱性感染的家禽及免疫接種后的家禽的抗體進行定性或定量的測定。主要技術(shù)包括凝集試驗、沉淀試驗、血凝與血凝抑制試驗、紅細胞吸附與吸附抵制試驗、補體結(jié)合試驗、病毒中和試驗和免疫標記技術(shù)等。

2 家禽采血技術(shù)

在禽病的診斷、治療、疫情監(jiān)測、免疫抗體水平監(jiān)測工作中，都需要采集家禽的血液樣本進行實驗室檢驗。采血方法的選擇，主要取決于采血的目的、所需血樣或血清的數(shù)量以及家禽的種類、年齡等。家禽的采血方法主要有以下幾種[2]。

2.1 冠髯采血

冠髯采血指將冠髯消毒后，用針頭直接刺破冠髯，擠出血液的采血方式。此法適用于用血量少、直接取用的試驗項目，多用于全血平板凝集試驗、血細胞性狀檢查、寄生蟲和微生物的血涂片檢查等。

2.2 跖骨內(nèi)側(cè)靜脈采血

跖骨內(nèi)側(cè)靜脈采血，指在消毒跖骨內(nèi)側(cè)靜脈的一定范圍，持注射器與跖骨皮膚呈10°角順跖骨內(nèi)側(cè)靜脈方向進針取血。適用于水禽和4 周齡內(nèi)雛禽。

2.3 靜脈采血

家禽靜脈采血有翅靜脈采血和頸靜脈采血2種方式。由于家禽頸靜脈采血技術(shù)要求高，左右手配合要得當，力度適當才能完成，因此，臨床常用翅靜脈采血。翅靜脈采血是將翼下靜脈術(shù)部消毒后，由翼根的肌肉處進針，向翅膀方向斜向刺入翼下靜脈，抽取血液的方式。此法可一次取血5～8 mL，用于用血量較大的試驗，多用于血凝與血凝抑制試驗中的紅細胞懸液配備及其他血清學檢查中禽血清的制備[3]。

2.4 心臟采血

家禽心臟采血分為雛雞心臟采血和成年雞心臟采血2 種方式。

1）雛雞心臟采血。將雞的鎖骨胸腔入口處消毒，持采血器以平行于頸椎的方式從胸腔入口處進針，抽取血液。此法取血量少于2 mL，適合5 周齡以下的雛雞。

2）成年雞心臟采血。將左胸壁消毒，持采血器于胸骨嵴突與肩胛骨末端連線中點處垂直進針，抽取血液。此法采血量大，出血快，適用于2 月齡以上的成年雞和用血量大的試驗。

3 血液樣本在實驗室檢驗中的應(yīng)用

在獸醫(yī)臨床檢驗中，血液樣本分為全血、血漿、血清3 種[4]。

3.1 全血的應(yīng)用

全血是將血液采集到采血器材內(nèi)所形成的混合物，包括血細胞和血漿的所有成分，適用于臨床血液學檢查。在禽病診斷中應(yīng)用全血的項目主要有血液涂片檢查、血常規(guī)檢查、全血平板凝集試驗、紅細胞懸液制備等。

1）血液涂片檢查。制備血液涂片用血量少，可采用刺破冠髯、腳蹼皮下靜脈等組織，以接種環(huán)或吸管直接取新鮮的血液，在載玻片上推出一層薄、透、均的血膜，經(jīng)瑞姬氏法染色后，用顯微鏡檢查。此方法可用于禽細菌性疾病的診斷，如大腸桿菌、禽霍亂、彎曲桿菌病、葡萄球菌病、鴨疫里氏桿菌病等，以及禽住白細胞蟲病的檢查。

2）血常規(guī)檢查。進行血常規(guī)檢查時用血量少，若可以在實驗室采血，可采用刺破冠髯、腳蹼皮下靜脈等組織，以毛細吸管直接取新鮮的全血，放入全自動血液細胞分析儀中，測定血常規(guī)指標。若需采血送檢，可采用翅靜脈采血，采血器中加抗凝劑，將抗凝全血送至實驗室檢測。此方法可為禽鐵缺乏癥、中毒?。拮扬炛卸尽Ⅳ~粉中毒）等確診提供依據(jù)。

3）全血平板凝集試驗。進行平板凝集試驗時用血量少，可采用刺破冠髯、腳蹼皮下靜脈或翅靜脈采血，取全血50 μL 與抗原50 μL 均勻混合，出現(xiàn)顆粒狀、片狀或團塊狀凝集時，判定為陽性反應(yīng)。此方法用于雞白痢沙門氏菌病、雞毒支原體感染的診斷，也用于禽結(jié)核的檢疫。

4）紅細胞懸液制備。在進行部分凝集試驗和吸附試驗時，需滴加紅細胞懸液，制備紅細胞懸液可采用翅靜脈或心臟采血，需血量較大，采集需要量的抗凝血，注入離心管中，加入等體積的阿氏液混合，用中性PBS 液洗滌3 次，將洗滌后的紅細胞配成試驗所需的雞紅細胞懸液。此方法主要用于間接血凝試驗和間接血凝抑制試驗、血凝試驗和血凝抑制試驗及紅細胞吸附和紅細胞吸附抑制試驗等。

3.2 血漿的應(yīng)用

血漿是離開血管的全血經(jīng)抗凝處理后，通過離心沉淀所獲得的不含細胞成分的液體，適用于血漿生理性和病理性化學成分的測定?？刹捎贸犰o脈或心臟采血，需血量較大，采集需要量的抗凝血，注入離心管中，經(jīng)離心分離取上層淡黃色液體，放入全自動血液生化儀中測定目標項。此方法可為禽中毒病（食鹽中毒）、營養(yǎng)缺乏癥、維生素缺乏癥、微量元素缺乏癥等病癥的確診提供依據(jù)。

3.3 血清的應(yīng)用

血清是離體的血液凝固之后，經(jīng)血凝塊聚縮釋出的液體，適用于臨床血清學和免疫學檢驗?？刹捎贸犰o脈或心臟采血，需血量較大，將采取的血液樣品試管呈最大斜面傾斜，并置室溫或37 ℃溫箱或水浴中預(yù)溫0.5 h，促使血清析出。待大部分血清析出后，中速(2 000～2 500 r/min)離心5 min，分離血清。用移液器將血清吸移到另一清潔而干燥的試管里，貼上標簽。放4 ℃冰箱保存待用，若不能及時檢測，可放入-15 ℃冰箱中凍存，需用時血清從低溫冰箱取出，經(jīng)4 ℃冰箱、室溫、37 ℃水浴條件逐步均勻融解，血清完全融解混勻后使用。解凍血清不宜反復凍融。血清在禽病診斷中主要用于以下試驗[5]。

1）凝集試驗。凝集反應(yīng)即細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在電解質(zhì)參與下, 抗原顆粒相互凝集形成團塊，這種現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。參與反應(yīng)的抗體稱為凝集素，抗原稱凝集原。常有平板法、試管法、玻片法及微量凝集法等?？捎糜谇輦魅拘员茄住⑶輳澢鷹U菌病、禽傳染性滑膜炎等病的診斷。

2）沉淀試驗?？乖c相應(yīng)的抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中會自由擴散，形成肉眼可見的沉淀帶稱為免疫瓊脂擴散試驗（沉淀試驗）?？捎靡阎乖恋砦粗贵w，也可用已知抗體測定未知抗原，特異性強，可用于禽流感、禽霍亂、雞白痢、馬立克、傳染性法氏囊炎、傳染性支氣管炎、傳染性鼻炎、傳染性腦脊髓炎、病毒性關(guān)節(jié)炎、雞包涵體肝炎、小鵝瘟等的診斷。

3）血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗。某些病毒或病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細胞的現(xiàn)象稱為血凝（HA）。當病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲兀瑒t紅細胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|。這時紅細胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細胞凝集抑制（HI）反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)。此方法可用于禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎、產(chǎn)蛋下降綜合征、雞痘、雞毒支原體病等的診斷。

4）補體結(jié)合試驗?？扇苄钥乖c相應(yīng)抗體結(jié)合后，其抗原抗體復合物可結(jié)合補體，但這一反應(yīng)肉眼無法觀察到，而通過加入溶血系統(tǒng)作指示系統(tǒng)，通過觀察是否出現(xiàn)溶血，來判斷反應(yīng)系統(tǒng)是否存在相應(yīng)的抗原抗體，該過程稱補體結(jié)合試驗。參與補體結(jié)合的抗體稱補體結(jié)合抗體。此方法主要用于禽衣原體病的診斷。

5）病毒中和試驗。中和試驗在家禽病毒病的診斷工作中，常用于用已知病毒來檢查未知血清，也可用已知血清來鑒定未知病毒，還可用于中和抗體的效價測定，其原理：病毒（抗原）與相應(yīng)的抗體中和以后，可知病毒喪失感染力，該反應(yīng)具有高度的種、型特異性，而且一定量的病毒必須有相應(yīng)量的中和抗體才能被中和。此方法主要用于禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎、雞痘、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥、番鴨細小病毒病的診斷。

6）免疫檢測技術(shù)。利用某些能夠通過某種理化因素易于檢測的物質(zhì)標記抗體，這些被標記的抗體與相應(yīng)的抗原相結(jié)合，通過對標記物的測定，從而為抗原定性或定量。該技術(shù)目前廣泛應(yīng)用的主要有：免疫熒光技術(shù)、免疫酶標技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)等。這些方法已用于多種禽病的檢測與診斷，如禽流感、新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合征、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥、傳染性腦脊髓炎、病毒性關(guān)節(jié)炎、傳染性鼻炎、小鵝瘟、鴨傳染性漿膜炎、雞毒支原體病、衣原體病等。

4 結(jié) 語

在禽病實驗室診斷和禽病監(jiān)測的核心技術(shù)家禽血液樣本采集、制備、保存及應(yīng)用的過程中，一些細節(jié)仍需進一步探究，如采血禽品種、日齡、性別的選擇、抗凝劑的使用、保存溫度、濕度的設(shè)定等，通過不斷實踐和應(yīng)用摸索出更精準的數(shù)據(jù)，為獸醫(yī)診斷、禽群免疫抗體水平監(jiān)測、疫情動態(tài)監(jiān)控提供科學依據(jù)。