李 娜， 王風云， 鄭 雁， 肖亞利， 萇沛森， 馬素好， 侯小麗， 姬新穎

(1.鄭州澍青醫(yī)學高等?？茖W校基礎醫(yī)學部，河南 鄭州 450064；2.河南應用技術職業(yè)學院護理學院，河南 鄭州 450000；3.河南大學醫(yī)學院，河南 開封 475000)

隨著人們壽命的延長和飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病腎病成為我國終末期腎疾病的重要病因，嚴重影響人類的健康[1]。腎纖維化是糖尿病腎病的主要病理改變，其纖維化程度與腎功能損傷息息相關，但目前臨床上尚無治療腎纖維化的特效藥物[2]。

鞘氨醇激酶1(SphK1)由Obinata等首次從大鼠腎組織純化提取出來，可催化鞘氨醇(Sp)生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)[3]。臨床上發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者腎組織SphK1活性增強，S1P水平增加[4]。蘭天等[5]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎臟SphK1-S1P信號通路被激活，促使腎功能損傷。相關研究發(fā)現(xiàn)，在高糖、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)和氧化應激等狀態(tài)下，SphK1被激活，S1P水平增加使腎小球系膜細胞(MC)增殖和遷移，進而分泌大量的炎性介質(zhì)和細胞外基質(zhì)成分，加速腎纖維化進展[6-10]。氧化應激是高糖介導組織損傷途徑的主要原因，也是腎纖維化形成的關鍵因素，貫穿于腎纖維化發(fā)生、發(fā)展的始終，在糖尿病腎纖維化的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[11-12]。因此，藥物是否通過氧化應激途徑激活SphK1-S1P信號通路，從而促進腎組織的炎癥及纖維化的進程尚不明確。

傳統(tǒng)醫(yī)學認為，糖尿病腎病患者多以腎病血瘀證為主要癥候，常伴有血尿，若單純用止血藥進行治療，可止血但不可化瘀，若單純用活血藥物進行治療，可化瘀但不可止血[13]。三七因具有活血和止血的雙重功效，已成為臨床上治療腎病血瘀證患者的首選藥物[14]。三七總皂苷是中藥三七的主要活性成分，具有抗氧化、改善微循環(huán)、抗炎、抗休克等藥理活性[15-16]。現(xiàn)代藥理研究顯示，三七總皂苷可改善糖尿病腎病模型大鼠的腎功能，延緩腎纖維化，但其具體作用機制尚不明確[17]。本研究基于SphK1-S1P信號通路，通過建立糖尿病腎病模型，探討三七總皂苷改善糖尿病腎病腎纖維化的作用機制，以期為尋找相關藥物提供新方向。

1 材料

1.1 儀器 BLT GelView 6000 Pro型化學發(fā)光成像系統(tǒng)(廣州博鷺騰生物科技有限公司)；穩(wěn)捷血糖儀(美國強生公司)；7600型全自動生物化學分析儀(日本日立公司)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；PowerPac型電泳儀(美國Bio-Rad公司)；RM2125 RTS型手動輪轉(zhuǎn)式切片機(德國Leica公司)；BX61型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；M200 PRO型多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 試劑與藥物 三七總皂苷(純度99%，含量80%，批號TB20171210)購自西安天寶生物科技有限公司。鏈脲佐菌素(STZ，批號SO1300)購自美國Sigma公司；尿微量白蛋白(mAlb)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號20170102B)購自中國原子能科學研究所；丙二醛(MDA，批號20171017)、還原型谷胱甘肽(GSH，批號20170815)、總超氧化物歧化酶(T-SOD，批號20170720)、血清胱抑素(Cys-C，批號20180714)、Masson染色試劑盒(批號20180521)均購自南京建成生物工程研究所；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1；Prime ScriptTMRT reagent kit(批號DRR041)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(批號RR820A)購自日本TaKaRa公司；S1P、C17-S1P對照品(純度大于97%)購自美國Avanti Polar Lipids公司。其余試劑均為分析純；水為超純水。

表1 PCR引物序列

1.3 動物 SPF級SD大鼠，雄性，10～16周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自河南省實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK(豫)2019-0002。大鼠飼養(yǎng)條件為溫度(23±1)℃，相對濕度(54±10)%，12 h/12 h明暗交替，自由進食飲水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 參照文獻[18]報道，大鼠適應性喂養(yǎng)1周后禁食12 h，分為正常組(12只)和造模組(38只)，造模組腹腔注射STZ溶液(65 mg/kg，臨用時以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液溶解)，正常組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，72 h后尾靜脈采血，禁食8 h后檢測空腹血糖(FBG)水平，連續(xù)4 d FBG均不低于16.7 mmol/L，則表明造模成功[19]。剔除造模不成功大鼠2只，將36只造模成功者隨機分為模型組和三七總皂苷高、低劑量組(62、31 mg/kg，臨用時以生理鹽水溶解)，每組12只，其中三七總皂苷組大鼠灌胃給予相應劑量藥物，正常組和模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周。

2.2 樣品采集 末次給藥后，大鼠轉(zhuǎn)入代謝籠中，收集24 h尿液，腹腔注射5%水合氯醛(6 mL/kg)進行麻醉，腹主動脈取血2 mL(空腹時間大于8 h)，2 000 r/min離心2 min，分離得血清，用于檢測生化指標。取血后，大鼠脫頸椎處死，取腎組織，分離腎皮質(zhì)，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于組織病理學觀察；另一部分用于腎組織氧化應激指標和相關蛋白表達的檢測。

2.3 大鼠FBG、體質(zhì)量檢測 造模成功后，各組大鼠每周定期尾靜脈采血檢測其FBG和體質(zhì)量。

2.4 大鼠腎組織肥大指數(shù)和腎功能相關指標檢測 取“2.2”項下大鼠腎組織，稱定質(zhì)量，計算其腎肥大指數(shù)。取“2.2”項下大鼠尿液，按照相應試劑盒說明書方法檢測mAlb水平。取“2.2”項下大鼠血清，采用全自動生化分析儀檢測血清BUN、Scr、Cys-C水平。

2.5 大鼠腎組織AGEs水平及氧化應激相關指標檢測 取“2.2”項下大鼠腎組織，加生理鹽水進行組織勻漿，按照相應試劑盒說明書方法檢測AGEs、MDA、GSH水平及T-SOD活性。

2.6 大鼠腎組織病理學形態(tài)觀察 隨機取“2.2”項下4%多聚甲醛溶液固定的大鼠腎組織，每組8份，經(jīng)水洗、乙醇脫水后石蠟包埋，切成4 μm薄片，隨機抽取一部分進行HE染色，另一部分進行Masson染色，在光學顯微鏡下觀察，選取400倍鏡下20個互不重疊的視野，采用Image-pro Plus 6.0軟件進行Masson染色半定量分析，計算腎膠原藍染面積。

2.7 RT-qPCR法檢測大鼠腎組織SphK1、FNmRNA表達 取“2.2”項下大鼠腎組織，每組5份，采用TRIzol法抽提總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系(20 μL)為SYBR Green Mix 10 μL，正向、反向引物各0.7 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA模板1.0 μL。反應條件為98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達，重復3次。

2.8 大鼠腎組織SphK1酶活性及S1P水平檢測 隨機取“2.2”項下大鼠腎組織適量，每組5份，加入裂解液裂解提取蛋白，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，參考文獻[20]報道方法檢測SphK1酶活性，以正常組為參照，計算其余各組相對酶活性。另隨機取“2.2”項下大鼠腎組織適量，每組5份，生理鹽水制備組織勻漿，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，取15 μL組織勻漿液，加入10 μL C17-S1P(內(nèi)標，10 μg/L)混勻，再加入75 μL甲醇，渦旋后12 000 r/min離心5 min，取10 μL上清液，采用LC-MS/MS法檢測腎組織S1P水平[21]，并以正常組為參照，計算大鼠腎組織S1P相對水平。

3 結(jié)果

3.1 三七總皂苷對大鼠FBG、體質(zhì)量的影響 與正常組比較，模型組大鼠第2～8周FBG水平均升高(P<0.05)，第4～8周體質(zhì)量均降低(P<0.05)；與模型組比較，三七總皂苷各劑量組大鼠第2～8周FBG水平降低(P<0.05)，第4～8周體質(zhì)量升高(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠FBG、體質(zhì)量比較

3.2 三七總皂苷對大鼠腎肥大指數(shù)及腎功能相關指標的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎肥大指數(shù)及mAlb、BUN、Scr、Cys-C水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，三七總皂苷各劑量組腎肥大指數(shù)及mAlb、BUN、Scr、Cys-C水平均降低(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠腎肥大指數(shù)、腎功能相關指標比較

3.3 三七總皂苷對大鼠腎組織AGEs水平及氧化應激相關指標的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織AGEs、MDA水平均升高(P<0.01)，T-SOD活性及GSH水平均降低(P<0.01)；與模型組比較，三七總皂苷各劑量組大鼠腎組織AGEs、MDA水平降低(P<0.05)，T-SOD活性及GSH水平升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠腎組織AGEs水平、氧化應激相關指標比較

3.4 三七總皂苷對大鼠腎組織病理形態(tài)的影響 肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠雙腎顏色紅潤，大小正常，包膜完整；模型組大鼠雙腎體積增大，顏色暗紅，皮質(zhì)較厚。HE染色顯示，正常組大鼠腎皮質(zhì)、髓質(zhì)分界清晰，腎小球、腎小管排列緊密，無明顯炎癥細胞浸潤，系膜細胞無增生，腎間質(zhì)未見增生及膠原纖維組織沉積；模型組大鼠腎小球體積增大，腎小管上皮細胞空泡變性，間質(zhì)增生水腫，有大量炎性細胞浸潤，腎小球周邊伴有大量纖維化組織沉積；三七總皂苷各劑量組大鼠腎組織的炎細胞浸潤、纖維化沉積明顯改善。Masson染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠膠原藍染面積增加(P<0.05)；與模型組比較，三七總皂苷各劑量組大鼠膠原藍染面積減少(P<0.05)，見圖1、表5。

表5 各組大鼠膠原藍染面積比較

3.5 三七總皂苷對大鼠腎組織SphK1、FNmRNA表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織SphK1、FNmRNA表達均升高(P<0.01)；與模型組比較，三七總皂苷各劑量組大鼠腎組織SphK1、FNmRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)，見圖2～3。

3.6 三七總皂苷對大鼠腎組織SphK1酶活性及S1P水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織SphK1酶活性、S1P水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，三七總皂苷各劑量大鼠腎組織SphK1酶活性、S1P水平均降低(P<0.05，P<0.01)，見表6。

表6 各組大鼠腎組織SphK1酶活性、S1P水平比較

4 討論

本研究通過單次腹腔注射STZ(65 mg/kg)復制大鼠糖尿病腎病模型，造模后大鼠的FBG不低于16.7 mmol/L，且腎小球體積增大，腎小管上皮細胞空泡變性，間質(zhì)增生、水腫，大量炎性細胞浸潤，腎小球周邊伴有大量纖維化組織沉積。經(jīng)三七總皂苷干預后，大鼠FBG、腎臟肥大指數(shù)、尿液中mAlb和血清中Scr、BUN、Cys-C水平均降低，腎組織炎性細胞浸潤與纖維化沉積明顯改善，表明三七總皂苷能改善糖尿病腎病模型大鼠的腎功能，與相關研究報道一致[22]。由于目前臨床上無治療腎纖維化的特效藥，故在本研究中未設置陽性對照組。

糖尿病腎病發(fā)病機制復雜，其中高血糖是引起糖尿病腎病的重要始動因素，晚期糖基化終產(chǎn)物AGEs的蓄積可激活體內(nèi)活性氧簇(ROS)水平，從而導致腎組織脂質(zhì)過氧化和炎癥反應，刺激促纖維化因子產(chǎn)生，進而加快腎纖維化進程[23]。氧化與抗氧化防御機制的失衡是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。GSH、T-SOD是組織內(nèi)常見抗氧化劑，其水平/活性多少體現(xiàn)組織抗氧化能力的強弱。MDA是花生四烯酸過氧化分解產(chǎn)物，是氧化應激的主要指標[24]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎臟中AGEs、MDA水平均升高，GSH水平及T-SOD活性均降低；經(jīng)三七總皂苷干預后，大鼠腎臟GSH水平及T-SOD活性均升高，AGEs水平降低，提示三七總皂苷可能通過上調(diào)腎組織GSH水平及T-SOD活性，發(fā)揮抗氧化作用，從而改善腎損傷。

在高糖、AGEs和氧化應激等狀態(tài)下，SphK1/S1P信號通路可被激活，從而調(diào)節(jié)腎纖維化進程[25-26]。Huang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性肺纖維化時，抑制Sphk1的活性可使人肺成纖維細胞(HLFs)中FN和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)水平降低，由此推測，抑制Sphk1活性可改善器官纖維化。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織SphK1、FNmRNA表達及SphK1酶活性、S1P水平均升高；經(jīng)三七總皂苷干預后，大鼠腎組織SphK1、FNmRNA表達及SphK1酶活性、S1P水平均降低，提示三七總皂苷可通過抑制SphK1/S1P信號通路活性，下調(diào)FN表達，進而延緩腎組織的纖維化進程。

綜上所述，三七總皂苷可改善糖尿病腎病模型大鼠的腎功能，其作用機制可能與抗氧化、抑制SphK1/S1P通路活性、下調(diào)FN表達有關。