鄭 蓉，鈄麗敏，魯丁丁

鈦和檢測認證集團股份有限公司，上海 200060

黃霉素（Flavomycin）又稱為斑伯霉素、默諾霉素A，是從灰綠鏈霉素菌（斑伯氏鏈絲菌）的發(fā)酵產(chǎn)物中分離的磷酸多糖類抗生素。黃霉素主要是通過干擾構(gòu)成細胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)肽聚糖的生物合成而抑制細菌的繁殖[1]，對大多數(shù)的革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有效。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要作用是通過影響腸道細菌的滋生，使腸道菌群的代謝活動變得有益于動物生長，間接改善了營養(yǎng)的消化和吸收，是一種新型的抗生素類藥物添加劑或促生長劑[2-5]。

黃霉素至少含有5 種活性成分，其主要活性組分為黃霉素A，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥質(zhì)量標(biāo)準中的規(guī)定，其含量應(yīng)大于總活性成分的50%，因此可以通過檢測樣品中黃霉素A 的含量來確定黃霉素用藥情況。黃霉素A 的檢測方法多采用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀（HPLC）或采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行測定（LC-MS/MS）[6-9]，液質(zhì)聯(lián)用儀雖然靈敏度高，但價格昂貴，基層檢測實驗室往往難以配置，且因飼料中黃霉素的含量高，用液相色譜儀就能進行精準檢測。本研究對黃霉素液相色譜檢測方法進行研究，黃霉素藥物經(jīng)色譜柱分離后可用紫外檢測器進行定性定量分析。該方法的建立可以提供結(jié)果準確可靠的黃霉素殘留測定，為養(yǎng)殖企業(yè)及時檢測飼料中黃霉素含量提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1）甲醇、乙腈、正己烷，為色譜級試劑（美國Tedia公司），其余為分析純試劑。黃霉素標(biāo)準品（99%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。

2）標(biāo)準儲備液：準確稱取一定量的黃霉素標(biāo)準品，分別用體積比1∶1 的甲醇水溶液超聲溶解，配置成1 mg/mL 的標(biāo)準儲備液。

3）流動相緩沖液：分別準確稱取3.0 g 庚烷基磺酸鈉、l5.5 g 磷酸氫二鉀、1.0 g 磷酸二氫鉀，加水溶解后稀釋至l 000 mL，用20%的磷酸溶液調(diào)節(jié)至pH 值為7.0±0.1。

4）Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配有紫外檢測器，CF16RXⅡ型離心機（HITACHI 公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 樣品處理方法

稱?。?.00±0.05）g 樣品于50 mL 離心管中，加入5 mL 甲醇水（體積比1∶1）溶液，振蕩5 min，50 ℃水浴超聲提取30 min，4 000 r/min 離心5 min，將提取溶液轉(zhuǎn)入另一離心管中，殘渣按上述方法再提取1 次，合并提取液。在提取液中加入5 mL 正己烷振蕩5 min，離心，去除上層，重復(fù)操作1 次，下層溶液過0.45 μm 水相濾膜，供高效液相色譜測定。

1.3 儀器分析方法

色譜柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，2.5 μm）；柱溫：40 ℃；柱流速1.0 mL/min；運行時間：50 min；進樣量50 μL；流動相為乙腈：緩沖液（35∶65，V/V）；檢測波長256 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性范圍與定量限

將1 mg/mL 的黃霉素標(biāo)準儲備液，用1∶1 的甲醇水溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、10、50、100 μg/mL 的標(biāo)準工作液，取50 μL 標(biāo)準溶液注入高效液相色譜儀中，按以上儀器條件進行分析，以黃霉素化合物的峰面積對應(yīng)質(zhì)量濃度做校準曲線。黃霉素藥物的線性回歸方程為：Y=6.786X+4.495，相關(guān)系數(shù)為0.997。

試驗測得在黃霉素加標(biāo)量為1.0 mg/kg 時，儀器信噪比＞3；加標(biāo)量為2.0 mg/kg 時，儀器信噪比＞10，同時回收率＞70%，精密度≤15%，因此將1.0 mg/kg 確定為方法檢測限，2.0 mg/kg 確定為定量限。

2.2 方法回收率與精密度

在陰性飼料樣品中添加3 個水平的黃霉素標(biāo)準溶液進行回收率試驗，每個加標(biāo)水平做6 個平行樣。測定結(jié)果顯示，平均添加回收率為83.9%～88.2%，相對標(biāo)準偏差為4.40%～10.20%（表1），空白飼料樣品加標(biāo)樣品色譜圖見圖1。

表1 飼料樣品中添加黃霉素的平均回收率和精密度

3 討 論

1）提取方法的選擇。黃霉素為有機弱酸，易溶于水，因此確定將有機溶劑與水混合后作為提取劑。同時，采用加熱超聲的方法能使溶劑完全滲透飼料肌肉組織，促進黃霉素的溶出。本試驗分別用純甲醇、30%甲醇水、50%甲醇水和70%甲醇水作為提取劑，在50 ℃加熱超聲30 min，比較提取效率，結(jié)果回收率分別為58.2%、77.4%、89.3%、82.7%，50%甲醇水溶液提取效率略高。此外，考慮到水相比例高的情況下，用正己烷去脂效果更好，確定采用50%甲醇水溶液提取。

由于飼料樣品中含有脂肪，需要對提取液凈化，常用的樣品凈化方法包括液液萃取和使用固相萃取柱等，黃霉素藥物結(jié)構(gòu)中有羥基，可以采用陰離子柱或C18 柱固相萃取凈化的方法，但是過柱凈化時間較長，操作步驟復(fù)雜。因此，利用黃霉素藥物不易溶于正己烷的性質(zhì)，采用液液萃取的方式。試驗采取在50%的甲醇水溶液中添加黃霉素標(biāo)準溶液，用5 mL 正己烷去脂2 遍，下層溶液上機測定，來考察正己烷去脂帶來的損失，結(jié)果回收率為99.6%，幾乎沒有損失。因此，可以采用在提取液中加入正己烷進行液液萃取的方法對樣品提取液進行凈化。

2）儀器條件的優(yōu)化。選擇高效液相色譜法較為常用的C18 柱作為色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃霉素在Agilent SB-C18 色譜柱上能獲得理想的分離效果，再采用2種儀器條件進行分析。A 的流動相采用藥典中推薦的0.2%甲酸銨與乙腈以45∶55 的體積比混合，紫外吸收波長為258 nm。B 的流動相采用離子對試劑庚烷磺酸鈉、磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀的混合液與洗脫能力較強的試劑乙腈以35∶65 的體積比混合。按B 方法分析的黃霉素峰形更好，穩(wěn)定性好，同時有效成分黃霉素A 與其他組分完全分離（圖1）。庚烷磺酸鈉在水中電離成庚烷磺酸鈉負離子，與胺類電離成的胺正離子結(jié)合，黃霉素分子中含有胺基，與庚烷磺酸鈉形成離子對，使各組分間得到很好分離。黃霉素在流動相中完全電離受pH 值及離子對試劑濃度影響較大。本試驗對流動相的pH 值、離子對試劑濃度、流速以及配比均進行了優(yōu)化，最后確定最佳儀器條件。

本試驗通過對色譜條件的優(yōu)化和樣品前處理方法的篩選，建立了飼料中黃霉素殘留量的高效液相色譜方法，該方法操作簡便，準確度和精密度均能滿足方法要求，可實現(xiàn)對飼料中黃霉素殘留含量的快速檢測。